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(無題) 削除/引用 No.3370-5 - 2010/10/20 (水) 14:39:25 - ~ 細胞株と薬剤のどちらに注目しているのでしょうか？ この薬剤がG2アレストを起こすことを示したいのであって、特定の細胞株の性質を見たいわけではないのでしたら、 無血清培地で増殖できる細胞、培地の系を使い、薬剤添加でG2アレストが起きることを示してはいかがでしょうか。 血清飢餓によるG1アレストが生じませんので、きれいに見れると思います。 細胞株が限定されるのであれば、過剰チミジン等でセルサイクルを揃えておいて、 S期に入ったあたりで血清の除去と薬剤添加処理をすれば、薬剤添加でG2/M、無添加でG0/G1などに止まるかもしれません。 ただ、S期はそれほど長くないでしょうから、タイムコースがシビアかもしれません。

(無題) 削除/引用 No.3370-4 - 2010/10/19 (火) 10:18:57 - おお >無血清または低血清でセルサイクルをストップさせてから薬剤を入れてみるとありますがそれは、細胞の播種を無血清で行い、薬添時にも無血清で行うということでしょうか？ それは細胞によりけりでしょう。無血清ではつきにくい細胞もあるようですし、 トリプシンは血清で中和した方がいいので通常のバイチでまず播くのが やりやすいとは思います。

＞おおさん 削除/引用 No.3370-3 - 2010/10/19 (火) 09:35:19 - monto blanc コメント、アドバイスありがとうございます。 確かにこの実験だけではｾﾙｻｲｸﾙｱﾚｽﾄは言いにくいとは思っています。 セルサイクルを促進する可能性を否定しなければいけないですよね。 無血清または低血清でセルサイクルをストップさせてから薬剤を入れてみるとありますが それは、細胞の播種を無血清で行い、薬添時にも無血清で行うということでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.3370-2 - 2010/10/17 (日) 11:47:27 - おお この実験だけでなら、解釈に可也バリエーションができると思います。 その薬剤がセルサイクルを促進する可能性をひていしなと、G2/Mきでの セルサイクルアレスとを証明しにくいです。DNA取り込み、各種サイクリン CDKの活性などから総合的に判断するのが望ましいといえますが、 まずそのシステムで出来る事は無血清または低血清でセルサイクルを ストップさせてから薬剤を入れてみるとセルサイクルの促進があるか ないかの情報が得られる可能性が高いと思います。

FCM：細胞周期 削除/引用 No.3370-1 - 2010/10/16 (土) 18:14:56 - monto blanc つい先日から、FCMを利用して細胞周期の測定実験を始めた初心者になります。 タンパク結合率が高い薬剤を無血清培地に溶かし、癌細胞に24hr処置する実験をしています。 アポトーシスの誘導が確認され、今回、細胞周期の抑制効果についてみることになりFCMにとりかかっております。 ・細胞をFBS(+)のMedium中に播種 ・24hr後：FBS(-)に薬剤を必要濃度溶かし（おおよそIC50値）、添加。 ・24hr後：上清に浮いた死細胞と接着細胞の両方をトリプシンにて回収 ・PBSにて２・３回洗浄を行い ・Trypan Blueにて各サンプルの細胞数を5×10^5に揃え ・エタノールにて一晩固定 ・遠心にてエタノールを除去 ・100mg/L RNaseを含むPBSを500μL添加 ・10mg/L PI試薬を添加 ・FCMにて測定 簡単ではありますが、以上のプロトコルにて行っております。 無血清培地では細胞がG0/G1にて固定されると思います。 通常、無血清培地で培養し、その後、通常濃度を含む血清にて細胞周期進行を再開させてから検出するようなのですが・・ 私の実験系の場合、薬剤を含んだFBS(-)で培養し回収してしまうので 測定までコントロールも処置群もG0/G1にある程度固定されたままになると思います。 その結果 コントロール群はやはりというか、【G0/G1：92%】でした。 処置群は【G0/G1：57%】【S：11%】【G2/M：28%】となりました。 これは、素直に、癌細胞に薬剤を処置すると、G2/M期に抑制がかかっていると解釈してよろしいのでしょうか。 処置群は、G0/G1期になる前のM期の状態で抑制がかかるので、G0/G1期がコントロール群に対して少ないのでしょうか。 無血清培地の意義が私の実験系には違った意味でのしかかっているような気がして、うまく整理ができず・・悩んでおります。 ご教授いただけると嬉しいです。 あるいは、プロトコルの改善法などもあればアドバイスいただけると嬉しいです。 ※薬剤をFBS(+)に溶解し処置しても、生存率に影響がみられませんでした。 ※処置群は、浮遊している死細胞も回収しているのですが、よろしかったでしょうか？（下に接着している細胞だけのほうが良いのでしょうか。）

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