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(無題) 削除/引用 No.337-14 - 2009/06/29 (月) 20:40:55 - ak 蛍光を撮るわけですから、必ず退色は起きるでしょう。蛍光の退職防止剤で反応を阻害しそうにないものというと、蛍光観察でよく使うTrolox(Sigma)という、Vit E誘導体があります。培地に100uM程度入れて使いますが、realtimePCRの場合だと、振ってみる必要があるかもしれません。これで効けばいいですね。

遅ればせながら試してみました 削除/引用 No.337-13 - 2009/06/29 (月) 20:15:22 - 南の島の「み」 当方も自作でカクテルを作り試してみました． スタンダード：β-actin ターゲット：SREBP-1 で，タカラバイオのEX Taq Hot Start Versionを使いました． ROX dyeは教えていただいた量の半分にしました． また，比較のためにABIのマスターミックスも使いました． 結果として，スタンダードの増幅はEX Taqの方が若干はやく立ち上がりましたが，プラトーの高さはABIのミックスには届きませんでした． また，ターゲットについて，自作カクテルでは増幅曲線の立ち上がりも遅く，ABIのミックスよりも6サイクル位（？）遅かったです．この辺はテンプレート量を変更することで対処できそうな気もするのですが・・・・どうでしょうか・・・ 当方は，試験群間の単純な比較を行いたいので自作カクテルの多少出来が悪くても良いかなと考えてましたが，まだまだ検討の余地有りと感じました． （見ているか分かりませんが）トピ主様のその後はどうだったのかお伺いしたいです． また，再度検討後に結果を報告させていただきます．忘れていなければ....

(無題) 削除/引用 No.337-12 - 2009/05/20 (水) 16:30:45 - おお >[Re:11] real-timeさんは書きました : > http://www.invitrogen.co.jp/qpcr/11760100.shtml > > にINVITRIOGENのKitに用いられているSYBR GreenERはSYBR IよりTaqを阻害しないと書かれてました。どうやらラボメイドとキットのシグナル強度差は、加えることのできる蛍光物質量の多さの違いのようです。 私も量の違いなのかなとちょっと想像してました。 > > また褪色防止剤ですが、酸化防止剤で代用できるのではと考えています。酸化防止剤によるPCRの阻害を避けるため、どのような物質がTaqをどのくらいの濃度で阻害するか、書いた表を探しています。私は以前にこのような表を見たことがありましたが、どこで見たか忘れてしまいました。どなたかご存知でしょうか？ えっと表は知りませんが2ーメルカプトエタノールとかDTTなら通常のPCR (ゲルで電気えいどうしてみたばあい)で殆ど問題ないので一度試されたらどうでしょうか。メーカーにもよるかも知れませんがすでに1mM位のDTTが酵素保存溶液に入っていたりします。 両者とも10mM位までは大丈夫じゃないかと思ってますが(濃度は単なる想像です)。その他システイン、グルタチオンなどマイルドな還元剤なら大丈夫な気がします。退色抑制効果はよく分かりませんけど。 しかしそんなに強い光を当てているんでしょうかね。 まシーンの光量って絞れないんでしょうか、、、、

(無題) 削除/引用 No.337-11 - 2009/05/20 (水) 11:56:06 - real-time http://www.invitrogen.co.jp/qpcr/11760100.shtml にINVITRIOGENのKitに用いられているSYBR GreenERはSYBR IよりTaqを阻害しないと書かれてました。どうやらラボメイドとキットのシグナル強度差は、加えることのできる蛍光物質量の多さの違いのようです。しかし上記ページに書かれていた比較広告のB社I製品よりは、ラボメイドの方が強度が強いような気がしました。 また褪色防止剤ですが、酸化防止剤で代用できるのではと考えています。酸化防止剤によるPCRの阻害を避けるため、どのような物質がTaqをどのくらいの濃度で阻害するか、書いた表を探しています。私は以前にこのような表を見たことがありましたが、どこで見たか忘れてしまいました。どなたかご存知でしょうか？

キットの蛍光色素は？ 削除/引用 No.337-10 - 2009/05/17 (日) 03:49:35 - real-time 774様 >SYBR green I を加えてカクテルを自作したことがあったが、測定中の蛍光の>退色が醜くて失敗した。 >純正品にはなにか、秘密のingredientが入ってるんだなと思ったわけだ >が、、。 INVITROGENの商品の中には、蛍光免疫染色用の蛍光退色防止剤入りのマウントもありますので、多分強力な退色防止剤が入っているのではと思います。多分、酸化防止剤があればある程度PCR中の退色を防げると思いますが、PCRを邪魔しない試薬だと何があるでしょうか？ 私の場合、退色は気が付かない程度でした。DenatureがPCR反応が1時間で終わる事(95C 20sec+95C 3sec, 60C 30sec 40cycle)と関係しているのかもしれませんし、キットよりPCR効率が若干低かったのが蛍光退色の影響かもしれません。 しかしプラトーの高さやPCR反応後に行ったdiassociation curveの高さでは、INVITROGENのキットに10倍の差をつけられました。キットはdiassociation curveのバックグラウンドも高く、PCR産物のアガロースゲル泳動では殆ど同じ産物量であったことから、検出誤差を差し引いても、キットの蛍光色素の質、量が、教えていただいた研究機関の組成（以下ラボメイドと略）と異なっているようです。 違いはもうひとつ、PCR産物の解離温度です。ラボメイドはPCR反応液中9.8%のDMSOが入っているせいかキットの産物より数度低く出ます。しかしラボメイドからDMSOを抜くと全く増えなくなります。DMSO濃度が違うのか、DMSOと異なるDNA変性を起こす物質が入っているのかのどちらかと思います。 キットとラボメイドの差を埋めるアイデア、情報をお待ちしています。

(無題) 削除/引用 No.337-9 - 2009/05/17 (日) 00:27:24 - 774 SYBR green I を加えてカクテルを自作したことがあったが、測定中の蛍光の退色が醜くて失敗した。 純正品にはなにか、秘密のingredientが入ってるんだなと思ったわけだが、、。

ご無沙汰しております 削除/引用 No.337-8 - 2009/05/16 (土) 08:39:01 - real-time Invitrogenのplatinum Taq antibodyが来ないので、待ちきれず教えていただいた組成のSYBR green I 溶液と、ラボメイドのHotstartでないTaqでreal-timeの反応を行いました。コントロール遺伝子は増幅したのですが、ターゲットの増幅の際多量のプライーマーダイマーが生じ失敗しました。次回はHotstartを開始しMgCl2濃度も調整しようと思っています。 ところで、私はABI7500FAST systemを用いています。plateとシールは現在ABI純正品を用いていますが、どなたかより安価の製品を試した方いるでしょうか？よろしければお使いになっているPCR plateのメーカと型番をお教えください。

TAQ抗体 削除/引用 No.337-7 - 2009/04/24 (金) 09:33:02 - niku Taq抗体は、Invitrogen、TOYOBO、タカラバイオなどから販売されていますね。 お試しされましたら、是非結果を教えてください。

Taq抗体？ 削除/引用 No.337-6 - 2009/04/17 (金) 16:15:50 - real-time あべちゃん様、どうもありがとうございます。お教えいただいた組成どおり溶液を作成して実験してみます。ただ、うちのラボメイドのTaqはHot Startでないため、反応の特異性は低下してしまいそうです。 Taq抗体は以前探した際には見つからなかったので、購入をあきらめていたのですが、もしどなたかご存知でしたら教えてください。

(無題) 削除/引用 No.337-5 - 2009/04/17 (金) 01:08:28 - あべちゃん > > １．SYBR Green I stock solution > > SYBR Green I nucleic acid gel stain 10,000x concentration in DMSO (Molecular Probes) > > を滅菌水で3800倍に希釈する。 > > この希釈したサイバーグリーンは−20℃とかで保存可能でしょうか?その際は遮光保存とかですか?御教授いただけると幸いです． SYBR Green や ROX referenceの試薬は基本的には必要な量だけ希釈すべきです。希釈した物をいつまでも保管すべきではないです。 しかし、3800倍ということもあり、結構大量にできてしまいます。 そこの研究所では、マイナス２０度で保管して使っていました。ただ、ルーチンで大量にこなしていたので、半年くらいしか保存していませんでした。茶色の遮光マイクロチューブに分注していました。 pre mix は、先ほども書いたように２週間以内に使い切るという方針ですね。 ラボ単位でみんなが使えば、結構、回ると思うんですが、一人でやった場合は、結構だぶつきますよね。ラボ全体で共通使用すれば、結構、有効だと思います。

(無題) 削除/引用 No.337-4 - 2009/04/16 (木) 20:39:03 - 南の島の「み」 real timeさん　横レス失礼します． あべちゃんさんに教えていただきたいことがあります． > １．SYBR Green I stock solution > SYBR Green I nucleic acid gel stain 10,000x concentration in DMSO (Molecular Probes) > を滅菌水で3800倍に希釈する。 この希釈したサイバーグリーンは−20℃とかで保存可能でしょうか?その際は遮光保存とかですか?御教授いただけると幸いです．

(無題) 削除/引用 No.337-3 - 2009/04/16 (木) 17:25:08 - あべちゃん 悲しいかな、うちのラボにはリアルタイム無いんですよね。 普通のRT-PCRで今はがんばってます。 宝の持ち腐れなので、役に立てて下さい。

(無題) 削除/引用 No.337-2 - 2009/04/16 (木) 17:23:01 - あべちゃん ある大きな研究機関が実際に使っているものを紹介します。 １．SYBR Green I stock solution SYBR Green I nucleic acid gel stain 10,000x concentration in DMSO (Molecular Probes) を滅菌水で3800倍に希釈する。 ２．2.0mM dNTP Mix stock solution Deoxynucleoside Triphosphate Set, PCR Grade 25 umol (250 uL) (Roche) ACGT原液100mMを混ぜ、2mMまで滅菌水で希釈。 ３．PCR premixの調整 １０ｘPCR buffer, 7uL 25 mM MgCl2, 2.8uL 2.0mM dNTPs, 5.6uL 1/3800 SYBR, 7uL SDW, 0.28uL ROX, 0.28uL DMSO, 4.9uL 10x PCR buffer: Qiagen/HotStarTaq DNA Polymerase Kit ROX: Invitrogen/ROX Reference Dye ４．PCR premixに対してサンプルを加える cDNA (6.25ng/uL Total RNA由来, 7uL SDW, 8uL HotStarTaq DNA Polymerase 0.35 uL 3. 4. の合計が49.93uLになる。 3.のプレミックスは前もってたくさん作ることができる。プレミックスは前日までに作成し、アルミホイルなどで遮光し、2週間以内に使い切る。DMSOと水とを先に混ぜて、熱を放出させる。 です。

Real time PCR kitの自作 削除/引用 No.337-1 - 2009/04/16 (木) 16:39:32 - real-time 現在Real-time PCRをTaqMan probeとInvitrogenのExpress qPCR superMIX universalで行っています。機器はABI7500FASTを使っています。結果には満足しているのですが、最近ラボ予算が逼迫してきたことから、できればラボメイドのTaqとSYBR Greenの系に移行したいと考えています。 キットを用いずにReal-time PCRを行っている方のTaq polymeraseの種類, Taq抗体の入手法や　SYBR GREEN を含む試薬組成、文献などを教えていただければ幸いです。 よろしくお願いします。

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