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(無題) 削除/引用 No.3365-14 - 2010/11/02 (火) 17:49:47 - つま sokさん 普通のGFPはphにsensitiveなので消光します。ただタンパクは結構残っているようです。 酵母ではGFP-Atg8をそのようにGFPのバンドシフトで液胞に行ったかどうかを見たりします。 培養細胞ではいまいちうまく行かない印象があります。 ただ培養細胞でもうまく行くことが有るようです。誰かが実験していたような、、、、。

(無題) 削除/引用 No.3365-13 - 2010/10/31 (日) 20:46:09 - sok つまさん、有難うございます。とても参考になりました。 ところで初歩的な質問になるのですが、GFPはリソソーム内で蓄積され続けるということはないのでしょうか？ GFPがリソソーム内での分解に耐性を示す特性を利用して、GFP-LC3発現細胞にてウェスタンをして（抗GFP抗体で検出）、GFP-LC3とcleaved-GFPの2本のバンドを確認する実験方法がありますよね？ GFPの細胞内での挙動に詳しくないものですみませんが、どなたかご存じでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.3365-11 - 2010/10/29 (金) 18:37:05 - つま ステーブルにするとまだ未分解でたまった。RFPポジティブなライソゾームだらけになります。 オートファジーは栄養条件でも少しずつ行われているのでこうなります。 Tf-LC3はチェイス実験的な意味合いもかねているので、発現は一過性に行うのが普通です。 水島先生等がいわれているように、一過性のLC3の発現には注意が必要なので、 データの解釈には気をつけた方が良いです。 詳しくはkimura et. al のautophagyの論文を見てみてください。 最初の論文です。

遅れましたが 削除/引用 No.3365-10 - 2010/10/18 (月) 01:22:08 - without 済みになってしまったみたいですが投稿させていただきます。 水島昇先生が、「捏造を防ぐ」みたいな連載をタンパク質核酸酵素で書かれていたときに、 GFP-LC3（だけではないでしょうが）が過剰に発現されると 細胞内で凝集体を形成してしまうというようなことが記されていました。 そういうアーティファクトを防ぐためにも トピ主さんがやるように、安定発現体を作って適切な発現量かつ、しかるべき条件でGFP-LC3が ドット状の構造をとるような、そういうクローンを選んでから実験に使うのが 望ましいのではと思います。 >話は戻りますが、GFP-LC3のtransfectionを行う場合、transientではリポフェクタミンなどの試薬の影響が問題となるようです。 以前情報を集めていたときに、トランスフェクションの操作自体が オートファゴソームの形成を促進してしまうとかがあったような・・。 これに関してはちょっと不確かです。

(無題) 削除/引用 No.3365-8 - 2010/10/17 (日) 13:26:04 - おお >[Re:6] sokさんは書きました : > おおさん、cDNAさんのご説明のとおりですが、従来のGFP-LC3のtransfectionではLysosome内酸性条件下のクエンチングが問題点でした。一方RFPは酸性条件下でも安定した蛍光を発するそうです。従って、RFP-GFP-LC3とすることで、オートファゴソームは黄色（緑と赤のmerge)に,オートリソソームは赤色蛍光のみ発するようになるそうです。 勉強になりました。

(無題) 削除/引用 No.3365-7 - 2010/10/17 (日) 13:05:33 - cDNA ヒト、マウス、ラットの種差による問題は、アプリオリには存在するが、ほ乳類に共通の現象を観察するという観点では大丈夫だと思います。サイトカインと受容体など、種が変わると効果がなくなる場合もちろんありますから、タンパクしつのインターラクションなど、問題が出てくるケースはあるでしょう。今のところ、LC3を含めオートファジーの分子機構は完全にわかっている訳ではないので、わかっている範囲での問題は見つかっていない、と言うことだと思います。

オートファジー　tfLC3 削除/引用 No.3365-6 - 2010/10/16 (土) 21:24:30 - sok おおさん、cDNAさんのご説明のとおりですが、従来のGFP-LC3のtransfectionではLysosome内酸性条件下のクエンチングが問題点でした。一方RFPは酸性条件下でも安定した蛍光を発するそうです。従って、RFP-GFP-LC3とすることで、オートファゴソームは黄色（緑と赤のmerge)に,オートリソソームは赤色蛍光のみ発するようになるそうです。 話は戻りますが、GFP-LC3のtransfectionを行う場合、transientではリポフェクタミンなどの試薬の影響が問題となるようです。（どのような問題を引き起こすのかは分からないですが…）なのでstable transformantの作製が望ましいと聞きました。 それとGFP-LC3,tfLC3のどちらでも言えることですが、Rat由来LC3のcDNAをヒト由来細胞に発現させて実験している方が多いようですが、それでオートファジーを確認することに何か問題はないのでしょうか？どなたかご存知の方いらっしゃいますか？

(無題) 削除/引用 No.3365-4 - 2010/10/16 (土) 19:41:09 - cDNA 単にtransientの方が早く実験できるから、という理由ではないでしょうか。stableだと、発現量が均等に近いし全ての細胞が発現しているので、実験は楽だと思いますが、作るのに時間がかかります。レトロなどウイルスを使えば、1、2週間でできるとは思います。 GFPの蛍光はpH依存で酸性コンパートメントでは光らなくなるが、RFPは一定、という理屈だったと思います。

(無題) 削除/引用 No.3365-3 - 2010/10/16 (土) 17:56:37 - おお transientの実験で示された範囲では、LC3の活性や性質は保持されていると とりあえずは考えますよね。ただし発現量が変わってくる可能性はあるので 注意が必要かとおもいますが。 GFP-LC3と比較しながら、どこまで大丈夫かなど確認しながら実験を進めていく てはないですか。ひとつずつ検証しながら進めていくのも科学的な手法ですよ。 後学のためききたいのですが、たんでむにRFPとGFPをつなぐのはなにを狙っているのでしょうか 差し支えなければ教えてください。

(無題) 削除/引用 No.3365-2 - 2010/10/16 (土) 17:10:45 - み 理論的には可能でしょうね。 やっている人がいるのかいないのか知りませんし、できないと考える理由も分かりません。 それを作る必要性があるのなら作って研究の発展に生かせば良いでしょう。

オートファジー　tfLC3 削除/引用 No.3365-1 - 2010/10/15 (金) 23:11:14 - sok オートファジーの研究に取り掛かかろうと、現在勉強中の者です。 皆さまアドバイス等、宜しくお願い致します。 実験でmRFP-GFP tandem fluorescent-tagged LC3（tfLC3）を細胞にtransfectionさせて用いたいと考えております。 GFP-LC3の場合は安定発現細胞株の樹立を行った上で様々な実験に応用できるようですが、tfLC3の場合安定発現細胞株を作成して実験に用いることはできないのでしょうか？文献を見ているとtransientの文献しか見当たらないので…。 どなたかご存知でしょうか？

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