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(無題) 削除/引用 No.3361-14 - 2010/10/15 (金) 21:18:21 - AP >ちゃんとリン酸化されていれば、重合がおこりモノマーで残っているものが見えないはず。 ああ、重合が不完全だった場合、末端が平滑になっていない可能性も残りますね。まあ前記の方法で、リン酸化にせよ、平滑化にせよ、問題がインサートの末端にあるのかどうかは、確かめられると思います。その場合、KlenowやT4 polで平滑化を加えて解決するかどうかで、リン酸化の問題か否かは見当がつくでしょう。

(無題) 削除/引用 No.3361-13 - 2010/10/15 (金) 17:50:10 - AP >脱リン酸化、リン酸化といった修飾過程は操作ごとにできたかどうかを確認する術が無いので、 脱リン酸化については、ligation/transformationの基本的なコントロールをそろえれば判断できるでしょう（insertなしで、ligationありvsなし）。 リン酸化がうまくいっているかどうかは、リン酸化反応後のinsertを一部とってligation（室温、短時間で十分）して電気泳動すればわかります。ちゃんとリン酸化されていれば、重合がおこりモノマーで残っているものが見えないはず。

(無題) 削除/引用 No.3361-12 - 2010/10/15 (金) 15:33:59 - おお >脱リン酸化、リン酸化といった修飾過程は操作ごとにできたかどうかを確認する術が無いので、最終的な結果のみしか書くことができないのですが、 全くないわけではありません。各操作でコントロールの取り方を工夫すればたいていそのステップの系が動いているかわかってきます。 ただしステップが多いので各ステップのコントロールをしっかり毎回取るのは一般的にはあまりしないというか、プロトコールにはそこまで書いてないです。 リン酸かがその系でうまくいくかは、脱リン酸かしたベクターを再度リン酸かしてやってライげーしょんしてやれば脱リン酸かしたものとの比較でわかるはずです。 >コロニーは48個ほど生えていました。ネガティブコントロールでは20個ほどでした。 そのコンスラクトがどの程度難しいかにもよりますが、チョットライゲーションしたわりには少なくないですか? ライゲーションがうまくいってないという見方もできます。お使いライゲーション試薬がワークしているなら、リン酸かか、PCRフラグメントの末端の形状にあるという勘ぐりは入れれます。PCRフラグメントを一度T4 DNA Polymeraseで末端を確実にしておいてライゲーションするのも手だと思います。それで効率が上がった経験はあります。 ひとつ気になるのは どれだけそのコロニーpcrが確実なのかです ただあなたの実験系を全て把握していませんのでどこまで有用なアドバイスかはわかりません。 ベクターはどれくらいの量トランスフォーメーションしたのでしょうか?

(無題) 削除/引用 No.3361-11 - 2010/10/15 (金) 12:34:36 - AP >この場合、ベクターの脱リン酸化を省くことは不可能と考えてよろしいでしょうか？ ベクターの脱リン酸化は、インサートを含んだクローンの数を多くするというより、セルフライゲーションのバックグラウンドを下げるのが目的ですから、まずうまくいったクローンが出てくるようにするのが先決です。 頻度が高ければ、ランダムにある程度の数を拾えば当たりがでるでしょうし、あるいはBlue/white selectionが使えれば、脱リン酸化をしなくてもいけるとは思います。 また、他の方も指摘しているように、ligation産物を再びSmaIで消化することが出来るなら(SmaI siteがインサートになければ）、ベクターの脱リン酸化だけでなくインサートのリン酸化も必要なくなります。同様の原理のキットはstratageneから出ています（PCR script）。 それと、先のレスで触れた、PCR後の処理には問題ないですか。 PCR産物のBlunt end ligationがうまくいかないのは、Blunt endが崩れていたためというケースが結構多いともいます。

追記です 削除/引用 No.3361-10 - 2010/10/15 (金) 11:52:11 - naniiro たびたび失礼します。 KODを用いたPCRでの産物は脱リン酸化された平滑末端の状態ということで、PCR産物のリン酸化、ベクターの脱リン酸化を行っています。 この場合、ベクターの脱リン酸化を省くことは不可能と考えてよろしいでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.3361-9 - 2010/10/15 (金) 11:51:03 - 中年 コロニーPCRがうまく行っていないだけって可能性はありませんか？試しに幾つかミニプレップしてみては？

ご指摘ありがとうございます 削除/引用 No.3361-8 - 2010/10/15 (金) 11:48:56 - naniiro ご指摘のとおりだと思います。 ありがとうございます。 脱リン酸化、リン酸化といった修飾過程は操作ごとにできたかどうかを確認する術が無いので、最終的な結果のみしか書くことができないのですが、 コロニーは48個ほど生えていました。ネガティブコントロールでは20個ほどでした。そのため、セルフライゲーションの確立は50%ほどかと推測しました。すべてのコロニーをピックアップして、ｺﾛﾆｰPCRを行ったところ、1つも非特異的なバンドも含めなにも増幅されていない。といった結果になりました。 ちなみにPCR過程で用いた酵素はKOD-Plusです。 PCR産物を1本鎖にすることでリン酸化されやすくなるのでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.3361-7 - 2010/10/15 (金) 11:36:17 - 中年 おおさんがお尋ねになっておられるように、「うまくいきません」の内容をもう少し具体的にお書きになった方が有益なコメントが得られると思います。

返信ありがとうございます 削除/引用 No.3361-6 - 2010/10/15 (金) 11:26:59 - naniiro Actiasさん アドバイスをくださり、ありがとうございます。 酵素処理後のベクターをゲル抽出することで、セルフライゲーションを防ぐことができるのでしょうか？ 教えてください。

(無題) 削除/引用 No.3361-5 - 2010/10/15 (金) 05:09:18 - おお コロニーが生えるが、外ればかりなのか、殆どはえないのか、全く生えないのか、ベクターだけのライゲーションと比べるとどうなのか、、、 そう言った情報から感じ取れるものもいろいろあり、対処方法もそれで思いついたりすることもあります。 インサートとベクターのジャンクションがSmaIを形成しないなら、ライげーしょんプロダクトをSmaIで切る手があります。 同時にこの手が使えるならベクターは脱リン酸かしなくてもすむはずです。 方法論ではまってしまうのもばかばかしいので(プラスミド を作るという観点で)プライマーを制限酵素処理できるタグを付けるとかするとブラントの制限酵素でもリン酸化末端を作ることができます。

(無題) 削除/引用 No.3361-4 - 2010/10/14 (木) 21:44:50 - Actias ベクター 脱リン酸化処理後にフェノール抽出を行うこと。フェノール抽出前にproK処理すればさらに良い。 と、書いて申し訳ないですが、ぼくなら、ベクターの脱リン酸化処理はしません。ベクターを切って、アガロース電気泳動で切れたベクターを回収し、フェノール抽出して使います。 PCR産物 産物はリン酸化処理前に95℃３分→アイスエタノールで急冷で、１本鎖にします。PCRがゲノムやRT-PCRでないなら、面倒だから、プライマーをリン酸化反応し、その反応液をそのままPCRに入れるかな？ この場合も、プライマーは熱→急冷で１本鎖化しておく。 ストラテジー インサートはベクターに入るんでしょうね？ ベクターもインサートも、平滑末端になっていますよね？

(無題) 削除/引用 No.3361-3 - 2010/10/14 (木) 20:53:30 - AP どういう酵素でPCRした産物なのか、PCR後にどういう処理をしたのかはひとつのポイントになると思います。 ストレートなTaqのように校正活性のない酵素を使ったのなら、もちろん3'末端の一塩基突出があるためにblunt-end ligationには不向きです。 校正活性のある酵素を使った場合だと、PCR後にそのまま漫然と保存すると、3' exonuclease活性によって削れ込みが起こり、3'陥没末端になってしまう可能性があります。PCRが終了したら速やかに酵素の除去または不活性化が行われているでしょうか。

(無題) 削除/引用 No.3361-2 - 2010/10/14 (木) 20:03:56 - ~ PCR産物の濃度が不明なため、メーカー推奨の範囲内なのかどうかが分かりませんが、他は問題のあるところは見当たりません。 (ATPは倍入れてもいいと思いますが、クリティカルでは無いと思います） もしterminal transferase活性を持つDNA polymeraseを使っているのであれば、Aが付いて邪魔をしているかもしれませんので、活性が無いもので試してみてはいかがでしょうか。 はまっているようでしたら、平滑末端でベクターから切り出した適当なフラグメントを用意して、ライゲーション時のコントロールとしてみてはいかがでしょうか。 ベクター側に問題がないことの確認になるかと思います。

DNAのATPリン酸化について 削除/引用 No.3361-1 - 2010/10/14 (木) 19:24:00 - naniiro PCR産物（インサート）をリン酸化し、 ベクターを Sma�T処理→脱リン酸化 両者をライゲーション。 という方法でプラスミドを作製しようとしています。 しかしながら、何度行ってもうまくいきません。 リン酸化以外の過程は、これまでのDNAworkにおいて何度も行っているのですが、 リン酸化の過程は初めてなので、うまくできているかわかりません。 以下のプロトコルで問題ないでしょうか？ 改善点あれば、教えていただきたいです。 TAKARAの T4 Polynucleotide Kinase､ATPを用いています。 10×T4 PNKbuffer 5 100mM ATP 0.5 T4PNK 1 PCR産物 1 dH2O 42.5 total 50 よろしくお願いします。

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