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(無題) 削除/引用 No.3352-13 - 2010/10/14 (木) 16:58:32 - やま 皆さんご回答ありがとうございます。 実は作成元の研究室で現在実験を行っておりまして、作成者に聞いてもお手上げ状態でしたので、質問させていただきました。 ただ、ここの作ったベクターは大丈夫なのかというのは愚痴に近い形で書いてしまったのですが、完全にここに書くべきことではありませんでした。大変申し訳ありませんでした。 もしインサートが大腸菌に毒性を持っているなら、新しいベクターでも同様のことが起きますよね。 大腸菌に関してはDH5αを使っています。手持ちにこれしかありませんので大腸菌種の検討はできませんが、まずはみなさんのご提案通り、低温培養を試してみたいと思います。 あと精製方法についても検討してみます。 皆さんご丁寧に誠にありがとうございました。

(無題) 削除/引用 No.3352-12 - 2010/10/14 (木) 09:45:44 - ~ 素直に考えるとインサートが大腸菌に悪さをしていて、 貴方がそのベクターを改変してもその性質が残る可能性は高いでしょう。 今のうちにそのインサートを扱える系を作っておいたほうがいいと思いますけど。 >どなたか解決策をご教示いただけないでしょうか？ �@分かる人に聞く そのベクターを作った人に現状を説明し、 その人がやった形質転換、大量調製のプロトコルを貰い、 そのプロトコルどおりに形質転換、大量調整を行なう。 �Aとりあえず手持ちのリソースで進める 今取れているコロニーを液体培養で大量に増やしてプラスミドを精製して使う。 グリセロールストックも作っておいて、入れなおしはしないようにする。 �B自分でやる 自分でクローニングして使う。 �C金で解決する イメージクローン等から購入して使う。 �A以降は、インサートを今後も扱うのであれば、自分で系を立ち上げる必要が出てくるでしょう。

(無題) 削除/引用 No.3352-11 - 2010/10/14 (木) 07:43:47 - おお APさんに一票です。 ほとんどAPさんとかぶりますが、、、、、 UVの当て具合が幾分過剰でも、大腸菌に形質転換して、そこからえられるプラスミドはUVのダメージをもってなく、リセットされているといってもいいかと思います。 ただ精製したときにニックがはいっているとかいう場合は効率がかなり落ちるかもしれません。一度チェックをしていなければやってもいいかと思います。 感触てきにはプラスミドがが何らかのメカニズムで大腸菌に悪さをしている可能性があります。そう言う場合は大腸菌を変えたりする事で改善される可能性はあるとおもいます。ベクター自身譲ってもらったのであれば、そちらの研究室でいくらか情報は持っているはずですので、使っている大腸菌やコンディションとか工夫があるかもしれませんので聞いてみた方がいいと思います。 一般的には大腸菌に対する悪さを抑えるために、コピー数を下げた状態で大腸菌を維持することが多いようです。30度あたりでの培養、抗生物質の減量とか です。37度でヒートショックというのも大きいプラスミドでリコンビネーションが起こりやすいときはよくやられるようです。

(無題) 削除/引用 No.3352-10 - 2010/10/13 (水) 23:37:11 - AP >ちなみにこの共同先ではベクター構築の際のゲル抽出で長時間UVを当てていて、正直ここが作ったベクター大丈夫なのかなという不安はあります。 先様が大腸菌で殖やしたものでしょうから、いまさらUVの影響云々とは的外れでしょう。関係あるとすれば、UVを当てたDNAのligation産物をトランスフォーメーションする段階であって、それをパスしたものなら（たとえUVによってなんらかのmutationが起こっていたとしても）コロニーが生えない理由にはならないんじゃないですか。まして、自前で生やしたコロニーから精製したプラスミドでも結果は同じなんですから。 また、プラスミドのニックも原因とは考えにくいです。そもそも、ligation産物は、そのまま大腸菌のなかで機能するわけではなく、大腸菌の修復系や topoisomeraseによる巻上げなどを経て生理的な状態になるのですから（ちなみに、脱リン酸したベクターを用いたligation産物は最初からニックが入った状態です）。 >膜たんぱくを導入した遺伝子 膜タンパク質遺伝子を発現ベクターに入れた場合、大部分の場合、大腸菌に対して毒性で、コロニーが生えてきにくいというのは良く知られています。 そういうことがよくあるので、毒性タンパク質に耐性の宿主（BL21(DE3)から選択されたC43(DE3)やC41(DE3)、商標OverExpress）なんかも開発されています。 宿主菌は何を使っているのでしょうか。pcDNA3.1なのでcanonicalな大腸菌プロモータは無いはずですが、それでもleaky expressionは起こる可能性はあります。pUC oriなので低温で培養するのは助けになるかもしれません（コピー数が少なくなる）。 いずれにせよ、根本的な困難があるなら、作成元でも苦労しているはずなので、注意点などについて、まず問い合わせてみては。それもなしに、 >正直ここが作ったベクター大丈夫なのかなという不安はあります。 なんていうのは、まったく失敬というものです。

(無題) 削除/引用 No.3352-8 - 2010/10/13 (水) 22:52:10 - ザンギ 先の投稿はamiさんとかぶったので削除しました。 まさかチャット状態とは．．． プラスミドの導入効率が悪いようですね。 理由はわかりませんが、そういうこともあるかもしれません。 ニックの入りやすい構造をしてるのかも。 抽出方法を変えてみるといいかもしれません。 あるいは相性の問題かも、可能であれば大腸菌の株を変えてみてください。

(無題) 削除/引用 No.3352-7 - 2010/10/13 (水) 22:45:53 - やま ザンギ様 ご返信ありがとうございます。 コロニーからDNA抽出してその日にトランスフォーメーションを行ってもきちんとコロニー生えてくれません。 同じ日に同じ作業をした他のベクターではきちんとコロニーが生えるのですが。。。

(無題) 削除/引用 No.3352-6 - 2010/10/13 (水) 22:43:07 - やま ami様 ご返信ありがとうございます。 生えたコロニーからDNAを抽出・精製してトランスフォーメーションしているのですが、それでもコロニーが生えない状態です。 他のベクターを抽出してトランスフォーメーションするときちんと生えてるのにこのベクターだけ何故かはえません。 何か理由分かりますでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.3352-4 - 2010/10/13 (水) 22:36:01 - ami > DNA精製度は260/280、260/230を見る限りでは問題ないようです。 > また、エタ沈、フェノクロ沈を行ってみましたがそれでもコロニー生えません。 ずたずたなっててもわかりませんよねこれじゃぁ･･･。 > これからこのベクターを使って、膜たんぱくの下流に制限酵素で別のタンパクも導入しようとしてます。 > そのため、現時点でコロニーがほとんど生えない状態なのに、このベクター使って別のタンパクをLigationしたとして、きちんとコロニーが生えるのかなという不安があり、質問させていただきました。 生えたコロニー増やして精製して使えばいいんじゃないですか。。

(無題) 削除/引用 No.3352-3 - 2010/10/13 (水) 22:34:22 - やま >ami様 早速のご返信ありがとうございます。 DNA精製度は260/280、260/230を見る限りでは問題ないようです。 また、エタ沈、フェノクロ沈を行ってみましたがそれでもコロニー生えません。 これからこのベクターを使って、膜たんぱくの下流に制限酵素で別のタンパクも導入しようとしてます。 そのため、現時点でコロニーがほとんど生えない状態なのに、このベクター使って別のタンパクをLigationしたとして、きちんとコロニーが生えるのかなという不安があり、質問させていただきました。

(無題) 削除/引用 No.3352-2 - 2010/10/13 (水) 22:24:28 - ami ご提示の情報では判断できませんが、、そのベクターが壊れているとか精製度が低いとか。まぁ、１つ生えれば十分じゃないかと･･･

トランスフォーメーションがうまくいかない 削除/引用 No.3352-1 - 2010/10/13 (水) 22:22:16 - やま はじめまして。 現在共同研究先で研究をおこなってるのですが、形質転換でつまづいています。 共同研究先が構築したベクター（pcDNA3.1にマウス由来の膜たんぱくを導入した遺伝子）のトランスフォーメーションを行っているのですが、コロニーがほとんど生えません。 たまにコロニーが一つだけ生えることがあり、このコロニーからDNAを抽出すると問題なくDNAを抽出できます。（制限酵素で確認した限りではサイズ的には問題ありません） 他のベクターでは問題なくコロニーが生えていますので、コンピテントセルの効率の問題ではないようです。 また抗生物質を間違っているわけではありません。 ちなみにこの共同先ではベクター構築の際のゲル抽出で長時間UVを当てていて、正直ここが作ったベクター大丈夫なのかなという不安はあります。 どなたか解決策をご教示いただけないでしょうか？

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