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(無題) 削除/引用 No.3350-14 - 2010/10/15 (金) 21:35:35 - Actias >これはInoue-Nojima法で作ったコンピの特長としてうたわれていること AP さん、ありがとうございます。 うちは、コンピを大量に使うので、Nojima法で作ってました。 それで、うまくいってるんですね。 Transformation buffer (TB) のpH がシビアと聞いたことがあったので、pH6.5とpH7.0で作って、混合比を変えて調子のいいのを使っています。 でも、だいたいどれも同じ程度で、コロニーが出て、満足いく値なのですけどね。

(無題) 削除/引用 No.3350-13 - 2010/10/15 (金) 15:19:47 - cDNA >>形質転換と温度の関係は、「イメージガール」が載っているころのToyoboのカタログに記載がありました。 >ToyoboのWeb siteでは今でも見られますし、原著論文もあったはず。 イメージガールが今でも見れるのかと、「一瞬」思いました。。。 カレンダーもイメージガールだった頃が懐かしいです。

(無題) 削除/引用 No.3350-12 - 2010/10/14 (木) 22:27:56 - AP >形質転換と温度の関係は、「イメージガール」が載っているころのToyoboのカタログに記載がありました。 >で、それを見ると、37℃から50℃くらいまで、そんなに効率にさがなさそうでしたので、 これはInoue-Nojima法で作ったコンピの特長としてうたわれていることで（Toyoboのコンピはこれで商品化しています。、すべてのコンピに通用するかどうかは疑問です。古典的ななHanahan法などでは結構、条件がシビアだったりしますけれど。 >形質転換と温度の関係は、「イメージガール」が載っているころのToyoboのカタログに記載がありました。 ToyoboのWeb siteでは今でも見られますし、原著論文もあったはず。

(無題) 削除/引用 No.3350-9 - 2010/10/14 (木) 22:09:55 - Actias トピ主さんの返事待ちですが。 形質転換と温度の関係は、「イメージガール」が載っているころのToyoboのカタログに記載がありました。 で、それを見ると、37℃から50℃くらいまで、そんなに効率にさがなさそうでしたので、ぼくは温度計を使わず、電子レンジで温めた温水に手を入れて、温度を見ています。 37℃の風呂だとぬるすぎるし、45℃だと熱くて入れない。 そんな感覚で計っても大丈夫と思いますので。

(無題) 削除/引用 No.3350-8 - 2010/10/14 (木) 08:50:48 - Fisher うちのラボの温度計は不正確でトランスフォーメーション効率が低かったのですが、このフォーラムで教えていただいた体温計を使っての補正（目盛り温度をずらして読むだけですが）をしたら、プレートに出るコロニーの数が一桁上がりました。ご参考までに。

(無題) 削除/引用 No.3350-7 - 2010/10/14 (木) 07:48:36 - おお それをちゃんとしたレポートとして、きっちり書いてみてください。

(無題) 削除/引用 No.3350-5 - 2010/10/13 (水) 21:45:00 - ザンギ 文面の感じでは学生実験か単に形質転換の練習か？ TEと薬剤なしの培地ではコントロールにならんと思うのですが。 手順で重要なのはheat shockだけだと思いますが．．． でもheat shock忘れてもちょびっとはコロニーが出来るらしいと聞いたことが あります。 ポジコンがないのですが．．． competent cellが経たってる可能性が一番高いでしょうね。

(無題) 削除/引用 No.3350-4 - 2010/10/13 (水) 21:22:02 - 江 その現象は繰り返し何度も確認されていますか？ Ap耐性をKmプレートへまいたなんてあほなミスはしてませんか？

(無題) 削除/引用 No.3350-3 - 2010/10/13 (水) 21:20:34 - 江 氷上インキュベーション時間なんて、相当てきとーでいいと思います 他のとこで何か間違いがあったんじゃないですかね？ 一応、当日やった操作を具体的に書いて欲しいです 菌株、heat shock時間、氷上に何分置いたか･････等等

(無題) 削除/引用 No.3350-2 - 2010/10/13 (水) 21:12:42 - Actias その操作をした背景（学生実習なのか研究なのか)、 使った大腸菌の菌株名称、 使ったプラスミドの名称（市販か自作か）、 大腸菌にプラスミドを導入する前の大腸菌への処理、 形質転換操作の温度と時間、 培地中の薬剤の濃度、 差し支えなければプロトコールの入手元 など、具体的なことを書いていただきたい。 ＞時間を計り間違えて、プロトコールの時間より長く氷上に置いてしまったので。 ＞他の部分はプロトコール通り正確に行いました。 と、言われても、アドバイスのしようが無いし、 「プロトコール通りやってください」 が答えになってしまう。

大腸菌のインキュベーション 削除/引用 No.3350-1 - 2010/10/13 (水) 21:07:10 - クロウリー 大腸菌に抗菌薬(Ap、Cm、Km、Tc)耐性遺伝子を組み込んだプラスミドを インキュベートしたのですが、形質転換が上手くいかなかったのか、 Ap、Cm、Km、Tcの入った各寒天培地で培養したところ、コロニーが全然出ませんでした。 コントロールとして、TE-bufferと大腸菌を普通寒天培地で培養したものでは、大腸菌の生育を確認できたのですが…。 インキュベーションが上手くいかなかったと思うのですが、 氷上でのインキュベーションの時間は正確に行わないと、 致命的なのでしょうか？ 時間を計り間違えて、プロトコールの時間より長く氷上に置いてしまったので。 他の部分はプロトコール通り正確に行いました。 どなたか、ご教授お願いします。

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