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BCA法でのタンパク質定量 トピック削除
No.3340-TOPIC - 2010/10/12 (火) 20:29:07 - JGSDF
まだまだ実験初心者で、簡単な質問なのでしょうがお願いします。

現在BCA法によるタンパク質定量を行っています。
ここで、サンプルの10倍希釈と5倍希釈溶液の測定を行ったのですが、どちらも吸光度が同じ値となってしまいました。各サンプルの組成は以下となります。

    5倍   10倍
sample 5 5
10%STE 0 0
10%SDS 5 5
DW 15 40

total 25 50 μℓ

単純にsampleが全体の1/5、1/10になるようにしたのですが…。

間違いがあれば、その理由も合わせて教えてください。
 
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(無題) 削除/引用
No.3340-5 - 2010/10/13 (水) 19:46:26 - JGSDF
ご返答ありがとうございます。
ご指摘のあった通り、再度実験原理から考えてみます。
そのうえで、まだ疑問が残るようなら質問させていただきます。

(無題) 削除/引用
No.3340-4 - 2010/10/13 (水) 01:00:38 - A
みなさんのコメントに追加するとSTEのTもしかしてTris?
BCA法は蛋白質のアミノ基を定量していますから(N末とLys)
Trisは少しでも入っているとかなり結果に影響します(経験済み)。
もしPirceか何処かのメーカーのキットでも使っているのなら
まずはBCA法の理論や何が反応に干渉するかなどを確認された方が
いいと思います。

(無題) 削除/引用
No.3340-3 - 2010/10/12 (火) 23:59:12 - おお
スタンダードとってから、コメントください。
たぶん低すぎるか高すぎるのではと。
あとはバッファーに不適切名ものが入っている可能性
還元糖なんかも影響します。

レスがつかないのは・・・ 削除/引用
No.3340-2 - 2010/10/12 (火) 22:26:05 - 笑い男
 内容が不十分なので、なんともコメントがしずらく・・・

STEって何の略ですか?
SDSを入れている理由は何ですか?
水で薄めるだけではダメなのでしょうか?
5倍や10倍に薄めても、サンプルが濃すぎるために反応が飽和しているとか?
逆にごくごく薄いサンプルを希釈したので反応が起こっていないとか?
サンプル中にキレート剤や還元剤(酸化剤)が高濃度で入っているとか?
ビシンコニン酸は入れたけど銅を入れ忘れたとか?

BCA法でのタンパク質定量 削除/引用
No.3340-1 - 2010/10/12 (火) 20:29:07 - JGSDF
まだまだ実験初心者で、簡単な質問なのでしょうがお願いします。

現在BCA法によるタンパク質定量を行っています。
ここで、サンプルの10倍希釈と5倍希釈溶液の測定を行ったのですが、どちらも吸光度が同じ値となってしまいました。各サンプルの組成は以下となります。

    5倍   10倍
sample 5 5
10%STE 0 0
10%SDS 5 5
DW 15 40

total 25 50 μℓ

単純にsampleが全体の1/5、1/10になるようにしたのですが…。

間違いがあれば、その理由も合わせて教えてください。

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