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(無題) 削除/引用 No.334-6 - 2009/04/22 (水) 15:31:14 - るる ats様、ありがとうございます。 事情によりGuHClが使えないので、8M尿素＋DTTで溶かしてやってみました。 残念ながら、再沈殿でもSDS-PAGEで見た純度はあまり変わりませんでした。さらに10%グリセロールに結構な量が溶解してしまって（こちらも純度は変わらず…）、再沈殿への回収効率が大変悪いという結果でございました。 私のはこうなりましたが、やはりモノによるのでしょう。 封入体を洗って純度を上げるのは取りあえず中止して、カラム精製の方向で検討してみることになりました。色々とご助言ありがとうございました。

(無題) 削除/引用 No.334-5 - 2009/04/17 (金) 12:09:10 - ats うろ覚えですので、数字は怪しいですが、 6M GuHCl+DTTに封入体を溶解させ、10%Glycerolで一気に20倍に希釈し、再沈殿。 これを6-10回繰り返す。 という方法を教わったことがあります。 実際に使ったことはありませんので、是非実践をお願いしたい。

(無題) 削除/引用 No.334-4 - 2009/04/16 (木) 16:46:45 - さく おおさま ご教授ありがとうございます。ナルホド納得です。 発現量も増やしたくて色々やったのですが、劇的に封入体が増えることはなかったです。 LB → TB培地で発現量そのものは増えたのですが、目的タンパクとそれ以外の割合はあまり変わりませんでした。 IPTGを増やすのとレアコドン対応大腸菌では、発現量は変わりませんでした。 ベクターはいくつか試して一番良かったのを使っています。大腸菌内のコピーナンバーは確認していませんが、一般的にhigh copyと言われるものを使っています。培養によるプラスミド脱落もほとんど見られません。 培養でこれ以上は無理かなと思っています。 いただいたご意見から考えれば、これ以上洗浄条件を検討するより、変性条件でカラム精製する検討をした方が良いのかもしれませんね。 タンパク質にタグをつけて無いので、カラムも色々試さないとダメかもと思うと、封入体洗浄だけでもっと綺麗になったらな〜という気持ちだったのですが、踏ん切りがつきました。 ありがとうございました。

(無題) 削除/引用 No.334-3 - 2009/04/16 (木) 15:56:21 - おお あとこうせい物質の加減で、大腸菌ないのプラスミドのコピーナンバ- を上げるとか、、、

(無題) 削除/引用 No.334-2 - 2009/04/16 (木) 15:54:05 - おお 洗浄の方法はそれなりにいろいろありますが、物が溶出しにくい条件にする ということだと思います。 たぶん封入体の純度に関係するのは洗浄の方法よりも、どれだけ大量の タンパクを発現できるかだと思います。 IPTGの濃度をあげるとか、レアコドンを改善した大腸菌を使うとか、 バイチをリッチにするとかでなるべく大量にタンパクを発現させる といいと思います。もしかしたら時間を長めにしてもいいかもしれません。

封入体の洗浄 削除/引用 No.334-1 - 2009/04/16 (木) 14:03:30 - さく いつも勉強させて頂いています。 大腸菌の発現系で、タンパク質を封入体にして発現させています。 CBBで分かる程度は発現しています。フレンチプレスで破砕し封入体を回収しました。このときの純度がCBBで10%程度といったところです。 その次に封入体を洗浄して、目的タンパク質の純度を上げたいと思っています。 封入体の洗浄だけで70〜90%ぐらいの純度になると嬉しいのですが、 洗浄液にTriton X-100を入れるとか、デオキシコール酸を入れるとか、 薄い濃度の尿素で洗うとか、本に載っているようなものは色々とやってみましたが、何度洗っても純度が上がったという感じになりません。 何回洗っても、ダラダラと目的外のタンパク質が洗浄溶出されます。 さらに目的タンパク質もわずかながら溶け出していっているようです。 これは洗ってるんじゃなくて単に薄めていってるだけじゃぁ…？ という感じです。 封入体に対してこういう洗浄をしたら純度が上がったという体験があれば 教えて頂けないでしょうか？ また、文献では封入体を洗浄して、ものによってはずいぶん綺麗になっているのを見かけます。 今回のような、洗浄時に少しずつ溶け出すようなタンパク質を扱う場合は、 洗浄で純度を上げるのは結構難しいものなのでしょうか？ 宜しくお願い致します。

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