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(無題) 削除/引用 No.3337-16 - 2010/10/29 (金) 15:46:16 - おお >肉眼的にtumor形成 それを、摘出して培養にもどすと転移しやすい ポピュレーションを濃縮できるかのうせいが有ります。

できていました！ 削除/引用 No.3337-15 - 2010/10/28 (木) 16:16:24 - yurie 本日、2週目でsacrificeしたところ5匹中1匹でしたが、肉眼的にtumor形成が認められました。 この分は、0.5mM EDTA in PBSで処理して、LLC 2×10^5/100μl/匹で静注したものです。 来週明け、LLC 1×10^6/100μl/匹と細胞数を増やして静注した分をまたsacrificeする予定です。 少し光が見えてまいりました。 皆様のアドバイスのおかげです。 ありがとうございます。 ゆき様 お礼が遅くなってしまい申し訳ありません。 いつもアドバイスありがとうございます。 大変、参考になります。 また来週の結果が分かりましたら、報告いたします。 引き続き何かありましたら、よろしくお願いいたします。

細胞のはがす方法 削除/引用 No.3337-14 - 2010/10/19 (火) 21:12:27 - ゆき 私は細胞処理にトリプシン・EDTAを使用していました。メーカーはデンカ生研のです。

(無題) 削除/引用 No.3337-13 - 2010/10/18 (月) 15:41:06 - おお ちょっと違うアイデアが浮かびました。 まず細胞を腹腔内でふやせないでしょうかねぇ。 細胞はへてろで培養を続けているとやはりポピュレションも かわってきますので、腹腔内で腹水中でさいぼうを増やすと 個体にせいちゃくしやすい細胞が確保できますし、 実験がし易くなるかもしれません。 固形癌だったら皮下で増やすか。

レスありがとうございます。 削除/引用 No.3337-12 - 2010/10/18 (月) 09:48:04 - yurie おお様 いつもコメントありがとうございます。 おかげで、ゆき様のコメントが頂けました。 ゆき様 ＞細胞数の最適化は必要 アドバイスありがとうございます。 細胞数を10^6に増やしてやってみます。 細胞数が増えると、今度はBoston様が指摘されているように塞栓に気をつける必要がありそうですね。 トリプシン→EDTAにかえてから、セルストレーナーは使うようにしました。 ちなみに、ゆき様は細胞をはがすときはどのような処理をしていますでしょうか。 Boston様 ＞拒絶反応が起きている可能性はないでしょうか？ 細胞をもらった方に確認したところ、その方はC57BL/6で皮下移植をされていたようですが、問題なく生着したとのことです。 皮下で生着するのであれば、拒絶反応は除外できると考え、接着因子等の問題かと思った次第です。 いつもアドバイスありがとうございます。 引き続きよろしくお願い致します。

(無題) 削除/引用 No.3337-11 - 2010/10/17 (日) 16:13:34 - Boston 私はインスリンシリンジを使っていましたーかなり細いです。マウス（B6）はランプで温めて、かつ消毒を兼ねて７０％エタノール綿で尾を擦って血管を広げていました。 以前、尾静注のトピでコメントしましたが、細胞種によっては肺の毛細血管に詰まってしまいます。間葉幹細胞の場合、５X１０＾５くらいでした。このとき、トリプシン処理をしていましたが生着も問題有りませんでした。 うーんさんがコメントされておられますが、拒絶反応が起きている可能性はないでしょうか？NOD/SCIDマウスで試すのも手だと思います。

細胞数およびニードル 削除/引用 No.3337-10 - 2010/10/17 (日) 15:00:30 - ゆき 同じ細胞でも、自分のラボとその論文にある細胞ではコンディションなど異なるので、やはり細胞数の最適化は必要かと思います。 ニードルですが、私はテルモのニードルで27G 3/4を使用しています。BALB/cは静脈が見えやすいですが、B6は固体によっては静脈が見えにくいですよね(汗)

(無題) 削除/引用 No.3337-9 - 2010/10/17 (日) 11:33:25 - おお >おお様 >26Gは太いでしょうか？ 実は思い出せないんですが、細いと細胞が壊れちゃうんで太いものを なるべく使うのが普通かと、、、ついでにどなたかやっている人から 詳しいコメントが話をふると気がついてくれて書くかもしれないと思った 次第です。 ipならもっと太い針を使います。21Gとか、、、

皆様レスありがとうございます。 削除/引用 No.3337-8 - 2010/10/16 (土) 23:17:04 - yurie 引き続きアドバイスありがとうございます。 うーん様 ＞LLCはB6に打たねばなりませんか？ 実験の設定上、C57BL/6になります。 特別な針ですか…（涙） 文献にはモデル作成はさらっとしか書かれておらず、簡単にできるとばかり思っていました。 ＞in vivo imager そういったことができれば良いのですが、残念ながら難しいです。 色々アドバイスありがとうございます。 ゆき様 コメントありがとうございます。 同じモデルを作成していた方のコメントで、本当にありがたいです。 いくつか文献を見ましたが、いずれも2×10^5/匹で、2Wできれいに転移巣ができていたので、その設定でやっていました。 細胞数を増やしてやってみます。 おお様 26Gは太いでしょうか？ i.v.すると、すっと静脈に流れていくのが分かるのですが…。 もちろん失敗する時もあります。 皆様のコメントを拝見して、少し元気が出てきました。 参考にしてやってみます。 引き続き何かアドバイスありましたら、よろしくお願いいたします。

(無題) 削除/引用 No.3337-7 - 2010/10/16 (土) 10:01:09 - おお >ツベルクリン針を使っていますので、26Gになります。 微妙なサイズですね。ぐぐると尾静脈だと25gが散見されます。なるべく大きな針がいいんでしょうけどivが難しくなりますから、、、

この実験 削除/引用 No.3337-6 - 2010/10/15 (金) 19:29:30 - ゆき 私もLLCを尾静脈投与して、肺がんモデルの作製を行った経験があります。そのときは1x10^6cells/mouseで行いました。理由は、このくらい投与しないとモデルができなかったからです(汗)報告されている論文をみると、4x10^5cells/mouseで18日後に解剖すると、きれいに肺がぐしゃぐしゃになっているのもありましたが、自分はだめでした。細胞の濃度をいろいろ変えて行ったことありますかな？

(無題) 削除/引用 No.3337-5 - 2010/10/15 (金) 19:23:01 - うーん 私のlabでもLLCを使って高転移株を作製している方がおられました。 その方はi.v用に特別な針を作らせて使用されておられました。 ちなみに、LLCはB6に打たねばなりませんか？ もしLLCがマウスの細胞であれば、同じH-2（ヒトでいうMHC）を一致させたマウスに打てば免疫拒絶なく生着することも容易かと思います。（LLCとB6が同じ遺伝的背景であるなら私の意見は無視してください。） 2wksでsacrificeして腫瘍が出来なかったのはなんとも時間が勿体ないなあと感じてしまいますよね。 LLCが発光するような操作を施した後、マウスにinjectして、in vivo imagerでマウスを生かしたまま腫瘍の出来を評価することも可能ですかね。 まあこんな大層なことをしなくても、そんなことをしなくてもできる！とかボスに言われそうですね。。。

レスありがとうございます。 削除/引用 No.3337-4 - 2010/10/14 (木) 10:25:15 - yurie おお様 ＞二ードルのふとさは？ ツベルクリン針を使っていますので、26Gになります。 ami様 ＞調整から打つまでの時間非常に大事。 調整するのに20〜30分程度、on iceで保存して静注しています。 計20匹ほどやっているので、処置が終了するまで1時間はかかっていると思います。 長すぎますでしょうか？ もっと手際よくやれるよう頑張ってみます。 しかし最初に打ったマウスも含めて全滅だったのです。 なので、そもそもの細胞液が問題なのかなと思った次第です。 引き続き、アドバイス頂けると嬉しいです。

(無題) 削除/引用 No.3337-3 - 2010/10/13 (水) 00:13:05 - ami 調整から打つまでの時間非常に大事。

(無題) 削除/引用 No.3337-2 - 2010/10/13 (水) 00:05:19 - おお 二ードルのふとさは？

Lewis lung carcinomaを静注する際の細胞調整について 削除/引用 No.3337-1 - 2010/10/12 (火) 15:06:31 - yurie 初歩的な質問で申し訳ありません。 Lewis lung carcinoma（以下LLC）を用いて、C57BL/6マウスに転移モデルを作成する実験を行っています。 周りに同様の実験をしている人がおらず、トピックを作成しました。 LLC 2×10^5/50μl/匹で尾静脈注射を行いましたが、2週間後にsacrificeしたところ病変が全くできていませんでした。 i.v.の手技は問題なくできているので、細胞の調整が問題と考えています。 行った手順は以下の通りです。 1）LLCをトリプシン処理 2）RPMI1640（10%FBS＋1%PC/SM）で回収 3）細胞カウント 4）遠沈して上清を除去し、cold PBS(-)で目的の濃度に調整 5）尾静脈注射 他トピ「マウスの尾静脈に投与する細胞の調整について」で、トリプシン処理をしてはいけないというコメントを拝見しました。 なので、次はLLCを0.5mM EDTA in PBSではがしてみようと考えています。 LLC転移モデルの文献を色々参考にしていますが、実際の細胞の処理については詳細が書かれていないのがほとんどで、もし同様の実験を行っている方がおられましたら、ご教授お願いいたします。

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