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(無題) 削除/引用 No.3335-4 - 2010/10/12 (火) 19:18:12 - DYM ＞中年さん そうですね、先ず幾つかピックアップしてコロニーPCRに使用します。 ある程度生えてきたらミニプレップ培養してみます。 回答ありがとうございました！ ＞おおさん 解かり易い説明で、勉強になります。 ベクター両末端でコロニーPCRしたら目的サイズが確認できました。有難うございます。

(無題) 削除/引用 No.3335-3 - 2010/10/12 (火) 16:50:31 - おお さてらいとのあるコロニーはその中心にあるものをピックアップすればいいです。 さてらいとであるなら、ピックアップしたのち、抗生物質にさらされた状態で は増殖しませんから、ほとんど問題はないはです。 個人的な好みですがベクター両末端かインサートとベクター末端の組み合わせがコロニーPCRにいいかと思います。 前者は入っていないものが短いサイズででますので、PCRのかかり具合が同時に確認できる （ただしインサートがはいって極端にかかりにくくなる可能性はある）が、方向がわからない。 後者は方向まで確認できるが、ポジこんがとりにくい。 インサートだけをふやすプライマーセットは条件は設定しやすいが、理論上フォールスポジを ひろう可能性もある。 がいして、その系が働くかどうか分からない状態で行わざるおえない状況なので、うまくいかなかったらまた条件かえてとかやっている状態になるなら、ミニプレップしてしまったほうが、 いいと言うのが個人的な印象です（これは実験にもよりますのでかならずしもよくない方法という つもりはありません）。 もしやるなら、３０ミニプレップセットしておいて、コロニーPCRをおこない、うまくいけばネガティブなコロニーをのぞいてミニプレップすると言うのはありえますが、そこまでコンストラクトに力をいれていられるかと言うのもありますね。 もうひとつコロニーPCRがあまり好きでない理由は、コロニーPCRしてもミニプレップして確認しないといけないのと、ライゲーションまでの過程をしっかりコントロールしてやるとまあブラントでも５０％ははいっているので、必要ないことがおおいです。

(無題) 削除/引用 No.3335-2 - 2010/10/12 (火) 14:56:47 - 中年 �AではコロニーPCRを行うには中央の転換体と考えられるコロニーをうまいこと採取するしかないんでしょうか？ そのとおりです。気になるならピックアップして別のプレートに引き直すことも有効です。 �Aではインサート内のプライマーを用いました。ベクター由来のプライマーを用いる予定ですが、これらについて、もし宜しければご意見をください。 たった30クローンなら、全部と言わないまでも幾つかミニプレップしてみたら？

形質転換後、サテライトが… 削除/引用 No.3335-1 - 2010/10/12 (火) 14:38:18 - DYM 大腸菌コンピテントセル作成後、早速�@pGEMベクター（ポジコン）と�A自作ライゲーションサンプルのトラフォを試みました。エレクトロポレーションでの形質転換です。 その結果↓ �@：5ng添加の結果、10^7ほどの転換効率が算出されました。 �A：30コロニーほどが生育。ただしコロニー1コゝにはサテライトがみられる。 �@は良しとしましたが、なぜ�Aではサテライトが発生したのでしょうか？調べると『形質転換体のコロニーによって、培地中の薬剤が分解されたため形質転換されていない（つまり、プラスミドを持っていない）ものもコロニーを形成してしまう現象』とありました。では、�AではコロニーPCRを行うには中央の転換体と考えられるコロニーをうまいこと採取するしかないんでしょうか？ちなみにコロニーPCRをしてもインサートの確認ができませんでした。 �Aではインサート内のプライマーを用いました。ベクター由来のプライマーを用いる予定ですが、これらについて、もし宜しければご意見をください。

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