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(無題) 削除/引用 No.3328-14 - 2010/10/09 (土) 18:38:21 - 293 masa　様 返信ありがとうございます。 書かれていること、よくわかりました。そして、とても勉強になりました。 私も、レポーターで何とかなるかなと思っていたのですが、気をつけなければならないことが分かりました。 FACSの方法も含め、検討してみたいと思います。

(無題) 削除/引用 No.3328-13 - 2010/10/09 (土) 15:29:00 - masa 蛍光タンパク質を光らせるには励起光を当てる必要があります。そのため細胞が混在している状態だと励起光が十分に当たる群と、他の細胞に邪魔されて十分に励起されない群が出てきてしまい測定結果にばらつきが出るのではないかということです。 FACSのように細胞一つ一つをしっかり測定できるのであればその影響は少なくなります。 ルシフェラーゼを一過性で発現させるのもちょっと問題点があります。その系が動くには細胞数に比例してルシフェラーゼを発現するコンストラクトが増えていかなければいけません。 しかし単なるplasmidを導入しても、細胞の増殖に伴ってplasmidの複製は起きない為、実際には細胞が増えているのに発光が増加しないという事態が想定されます。 もちろんplasmidを導入された細胞が薬剤処理によって弱ることでルシフェラーゼ遺伝子の転写、翻訳などが抑制されて発光量が低下することは考えられますが、どこまで細胞数と相関した値が出てくるか検討する必要があります。 自分で提案しておいて今更ですが蛍光、発光で見る場合も細胞が死んで培地中に排出されても活性は残りますので、293様が見ようとしているのが増殖を検討するのでなければしっかり細胞数を反映していない可能性が出てきます。原理的にはMTTにもその可能性があると思います。

(無題) 削除/引用 No.3328-12 - 2010/10/09 (土) 09:20:20 - 293 masa　さん 返信ありがとうございます。 ちょうど、dualのプラスミドがありますので、ちょっとtransientでも試してみようかと思います。 一つ初歩的な質問で申し訳ないのですが、 ＞蛍光タンパク質をレポーターとして使うと励起光を当てる分値がぶれる とは、どういうことでしょうか？もし、蛍光タンパクが使えるのであれば、luciferaseよりも簡便で安価にできる気がします。ぶれるかは、やってみなければ分からないことでしょうか？それともぶれるのは一般的でしょうか？用いる2つの蛍光を考えなければなりませんかね？ また、質問してしまい、申し訳ありません。

(無題) 削除/引用 No.3328-10 - 2010/10/09 (土) 00:24:47 - masa プロメガ社等で販売されているデュアルルシフェラーゼのコンストラクトを一つづつそれぞれの細胞に安定発現させ、その発光量を目安として測定するのはどうでしょうか？元々一つのwellで二つの発光を検出する系ですので。 蛍光タンパク質をレポーターとして使うと励起光を当てる分値がぶれる気がしますので細胞を溶解して発光のほうがよろしいかと。 なんとなく今思いついただけですので一般的な方法ではないと思います。。。

(無題) 削除/引用 No.3328-9 - 2010/10/08 (金) 23:43:24 - 293 ami さま どうもありがとうございます。 FACSの方法、検討してみます。

(無題) 削除/引用 No.3328-8 - 2010/10/08 (金) 23:40:28 - ami > 私の希望としては、あまり多くない処理で測定に持っていきたいと考えております。 96 well plateで培養してた培養液の中に、PIと抗体のカクテル入れて、そのまま測定･･･ものすごい少ないステップだと思うけど･･･

(無題) 削除/引用 No.3328-7 - 2010/10/08 (金) 23:38:16 - 293 ami さま コメントありがとうございます。 あさんもおっしゃる通り、FACSでは、確かに確実にできる方法かと思います。 私の希望としては、あまり多くない処理で測定に持っていきたいと考えております。 最終的には、FACSにて確認はしようと思います。現在、多数の薬剤を扱っており、全ての薬剤をFACSで行うのは、厳しいもので。これより簡便な方法がありましたら、ご教授いただきたいと思います。

(無題) 削除/引用 No.3328-6 - 2010/10/08 (金) 23:17:13 - ami FACSあったら超簡便だと思うけどなぁ･･･96wellでもいけるし。 近くの研究機関で借りられないですか。

(無題) 削除/引用 No.3328-5 - 2010/10/08 (金) 23:15:23 - 293 皆様、早速の返信ありがとうございます。 Actias　さん ＞同じ培養容器に2種類の細胞が存在している、ってことですね？ はい。そうです。最終的には、96-wellフォーマットでできる簡便な方法を探しております。 ＞細胞１個ずつを見るという想定ですか？ はい。 少し詳しく書くと、ある薬剤を２種類の細胞が入った培養容器に添加し、それぞれの細胞に対する毒性を評価したいのです。それを、簡便な方法で評価したいということです。 本実験はまだ始まっておらず、レポーターによるマーキングができるかどうかは未確認です。 この様な実験をされている方について、どのようにされているのかが知りたいと思い、投稿させていただきました。 ＞「見たいこと」と「見れること」の関係がしっくりしません。 とても、あいまいな質問で申し訳ありませんでした。 早速返信していただいたことに、感謝いたします。 あ　さん ＞FACS 残念ながら、ありません。 上にも書いたのですが、96-well等の簡便な方法を探しております。

(無題) 削除/引用 No.3328-3 - 2010/10/08 (金) 22:26:51 - あ FACSはありますか？ PIとそれぞれの細胞のマーカーで染めれば良いのでは？

(無題) 削除/引用 No.3328-2 - 2010/10/08 (金) 21:46:28 - Actias 「同時に培養」 同じ培養容器に2種類の細胞が存在している、ってことですね？ 「それぞれのシグナル強度」 細胞１個ずつを見るという想定ですか？そのシグナル強度が細胞の生き死にを反映しているならできるとおもいますが。 細胞の集団として見るのですか？そのシグナル強度が細胞の生き死にに関係ないなら、それぞれの細胞の存在比率は見れます。 レポーターによるマーキングができるなら、マーカーで細胞を区別し、トリパンブルーで生き死にをみる、と言うのができそうです。（今思いついた実験方法ですけど) 「見たいこと」と「見れること」の関係がしっくりしません。

二種類の細胞生存率を一度でみる方法 削除/引用 No.3328-1 - 2010/10/08 (金) 21:12:59 - 293 初めまして。 現在、培養細胞を二種類同時に培養し、それぞれの細胞生存率を観察する（数値化する）実験を始めようと思っているのですが、一般的な方法はあるのでしょうか？前回は、接着細胞と浮遊細胞の同時培養でしたので、それぞれを分離して、MTTなどで容易に分かったのですが、今回用いる細胞株は、両者浮遊細胞で、同じような性質を持っています。 今、考えているのは、それぞれにCMVなどを持った異なったレポーターを有するベクターをトランスフェクションし、それぞれのシグナル強度を測定する方法を考えております。 もし、アドバイスをいただけたらと思います。 どうぞよろしくお願いいたします。

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