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回答ありがとうございます。 削除/引用 No.3326-3 - 2010/10/08 (金) 17:14:23 - SU 目的のタンパク質の分子量は65kDaと35kDaです。 30%Acrylamide(29%(w/v) Acrylamide、1%(w/v) N,N'-Methylenebis acrylamide)を用いています。 ゲルの組成は Acrylamide 33%(v/v) lower buffer(1.5M Tris-HCl,0.4% SDS) 25%(v/v) 50%(v/v)glycerol 13%(v/v) DDW 28%(v/v) 10%(w/v)APS 0.67%(v/v) TEMED 0.06%(v/v) 内部基準タンパク質の分子量は121kDaで、 上記のゲル組成で、上部で（ウェルに近い方）検出されました。 また目的のタンパク質以外の分子量81kDaのタンパク質も 内部基準タンパク質より少し下で検出されました。 上記組成のゲルで少なくとも分子量65kDaのタンパク質は 検出されてもいいと思いますが、、、、 膜タンパク質は極微量であるので 試料の量を倍にして電気泳動を行いましたが検出されませんでした。 抽出中に分解ということは、 試料を作製する段階でタンパク質が細かく分解されてしまった ということでしょうか。 お手数お掛けしますが、ご回答宜しくお願いします。

(無題) 削除/引用 No.3326-2 - 2010/10/08 (金) 16:05:26 - in situ >タンパク質がうまく分解されていないため、 >メンブレンの下に太いバンドが検出されたと考えているんですが、 >sample bufferの調製に問題があるのでしょうか。 メンブレンの下って、wellから遠い方っていうことですよね？ だとすると、本来の分子量より小さいところにバンドが出ているのでは？ すると、「分解されていない」のではなく、抽出中に分解されてしまったのではないでしょうか。 あと、みようとしているタンパク質の分子量はいくつくらいでしょうか？ ゲルのアクリルアミド濃度と分子量が合ってなくて分離できていない可能性もあります。

Laemmli's sample bufferを用いた電気泳動 削除/引用 No.3326-1 - 2010/10/08 (金) 15:58:09 - SU こんにちは。 Western blot法によるSNAREタンパク質の検出をやっています。 試料をLaemmli's sample buferにて可溶化し 電気泳動させているんですが、 目的物質のタンパク質のバンドが検出されず、 メンブレンの下に太いバンドが検出されました。 Laemmli's sample bufferは CHAPS cell extract buffer(pH6.5)と SDS sample buffer(pH6.8)を1:1の割合で混合したものを使っています。 混合溶液に内部基準タンパク質と試料を加えてボイルし ゲルのウェルにapplyして電気泳動させています。 試料はタンパク質量が5μg/laneになるようにして加えているので 多すぎる量ではないと思います。 タンパク質がうまく分解されていないため、 メンブレンの下に太いバンドが検出されたと考えているんですが、 sample bufferの調製に問題があるのでしょうか。 初歩的な質問で申し訳ありませんが、 ご回答のほど宜しくお願い致します。

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