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(無題) 削除/引用 No.3326-23 - 2010/10/12 (火) 17:05:58 - ？ ＞もっと確認することがあるとしたら、 そもそもさんの稚拙でない確かな意見をお聞かせぐださい。 その前に、アドバイスを求めるのなら、 何をやってみたのかとかの情報が無いと・・・。 稚拙でない確かな意見は 稚拙でない質問より生まれると思います。

(無題) 削除/引用 No.3326-22 - 2010/10/12 (火) 16:55:57 - おお これって一度はうまくいっているんですよね。 なのでバッファーのせいにするのはちょっと唐突過ぎませんか、、、 検出されるサイズが３５なのか、タンパクの配列から３５と考えているのかも よくわからないですがどうなんでしょう、、、

(無題) 削除/引用 No.3326-21 - 2010/10/12 (火) 16:36:33 - そもそも ＞いろいろと問題点を考え、何回も実験を行った結果、 どのようなことをやったかを挙げてなく、 ＞初歩的な質問で申し訳ありませんが、 ご回答のほど宜しくお願い致します とあったので、初歩を申し上げたまで。 ＞思いつきでbufferのみを疑った訳ではありません。 そんなこと、こちらにはわかりませんでしたので。

そもそもさん 削除/引用 No.3326-20 - 2010/10/12 (火) 15:06:53 - SU 膜たんぱく質の検出は容易ではないことよく知っています。 いろいろと問題点を考え、何回も実験を行った結果、 bufferが疑わしいと考えたので 思いつきでbufferのみを疑った訳ではありません。 もっと確認することがあるとしたら、 そもそもさんの稚拙でない確かな意見をお聞かせぐださい。 ちなみにsample bufferの調整を行ったところ、 良い方向に進展がありました。

ｈｙｄさん 削除/引用 No.3326-19 - 2010/10/12 (火) 14:58:47 - SU 今はまだ実験が未熟で、 加熱処理したsampleと未処理のsampleの比較をすることができませんが、 実験操作が確立したらぜひ比較してみたいと思います。 貴重なご意見ありがとうございます。

おおさん 削除/引用 No.3326-18 - 2010/10/12 (火) 14:52:43 - SU ご意見ありがとうございます。 PBS保存の段階ではプロテアーゼインヒビターは入っていません。 sampleをwestern以外の実験でも使うので、 PBSに溶解させただけで保存しています。 今度からは、sampleをlysis bufferに溶かし プロテアーゼインヒビターが入っている状態で保存したいと思います。

(無題) 削除/引用 No.3326-17 - 2010/10/12 (火) 01:44:34 - そもそも タンパク質は、いろいろな化学的な性質を持つアミノ酸からなっているため、 いろいろなことが起こるので、一筋縄でいかないこともあると認識すべき。 その心構えで普通はみんな実験するので、バッファーの組成だけを疑うのは、 あまりに稚拙なことであるということ。 もっと確認することがあるよ、ってこと。

(無題) 削除/引用 No.3326-16 - 2010/10/11 (月) 14:48:01 - hyd ATCGさんの書いておられる膜タンパクは加熱しない方が良いというのは、一概には言えません。たしかに加熱したらアグってだめなものもありますが、むしろboilしないとだめなものもあります。強い疎水性結合を取ってるSNARE類が有名で、95度以上でないとタンパクの疎水性結合の部分をSDSで完全に置き換えることができず、立体構造が残るので、本来より早めに泳動します。それで膜タンパクの場合は、処理条件を振ってみられた方が良いです。ルールはなく、また、完全にSDSで変性できる範囲も狭いので。

(無題) 削除/引用 No.3326-15 - 2010/10/11 (月) 14:28:39 - おお ちょっと気になっていて、書きそびれていたのですが、サンプルのdegradationが気になります。PBS中で保存ということですが、その段階でプロテアーゼインヒビターが入っていましたでしょうか。それと10%で35kDaですよね。少しゲルの具合が誤差で緩かったりしたら先頭を走りませんでしょうか、、、これはマーカーがその辺りにあれば気がつくはず。

加熱処理；； 削除/引用 No.3326-14 - 2010/10/11 (月) 13:34:04 - SU ATCGさんご指摘ありがとうございます。 確かに既往研究ではsampleの加熱処理は行ってなかったみたいです。 sample buferに溶かして、加熱処理した方が SDSがくっつき安いと聞いたのですが、、、 もう少し検討します。 抗体は希釈して100μLずつ分注して冷凍保存させています。 解凍して使い切っているので再度凍結はさせていないのですが、、、 なにか抗体がダメになる原因ああるかも知れませんね；； もう少し勉強します。 たくさんのご意見ありがとうございます。

ｈｙｄさんご意見ありがとうございます。 削除/引用 No.3326-13 - 2010/10/11 (月) 13:25:27 - SU 自分もCHAPSとSDSを1：1で混合させてる点は気になっていました。 CHAPSの組成を変えてもう一回やってみます。

hydさん 削除/引用 No.3326-12 - 2010/10/11 (月) 13:20:28 - SU

(無題) 削除/引用 No.3326-11 - 2010/10/09 (土) 23:35:19 - ATCG ゲルトップやフロントラインは分離しきれなかったいろんなやつまとまって集まるとこだから、たまたまそういうのが引き起こした変な非特異的反応かもしれないから、本物かもしれないけど、あんまりとらわれすぎないで、一歩引いて見たほうがいいかもね。本来の位置にでてたものと、フロントの所に出るもの比べてみてシグナル強度的にはどうかな。保存中の蛋白質分解はインヒビターいろいろ入れてても、SDS変性サンプルでも、扱いによっては確かにおこるけど、それでも普通はかなり緩慢で凍結融解のたびにだらだらというかんじで、そんなに急にきれいにバラバラになるというのは感覚的にふつうとはちょっと違うとおもう。非常に分解されやすいのか、その蛋白質を特異的に壊すようななにか強力なプロテアーゼがあるのか、またそういうのがSDSで構造が変化して活性化されるとか、プロテアーゼ感受性部位が変性によって露出するとか、何かその蛋白質にまつわる特殊事情があるのかなあとおもいました。 分解があやしいならば、とりあえず最初のサンプル調製の時に、一気にSDSサンプル／加熱処理まで持って行ってから、分注して-80Cで凍結保存、それで溶かしたら使い切り、というのがいいかな。 あとね、こういうクセのある蛋白質を相手にするときは抗体はポリクロがいいよ。モノクロだともし端っこのほうにエピトープがあるとちょっと欠けたらもう認識できなくなるからね。 抗体が駄目になった可能性もあるね。抗体の失活は100がいきなり０みたいなかんじで突然来るからね。 膜蛋白質ならば加熱処理はしない方がいいよ。アグってゲルはいらなくなるときあるから。そのアグリゲーションの具合の差で入ったり入らなかったりすることで結果が安定しないこともあるし。。

(無題) 削除/引用 No.3326-10 - 2010/10/08 (金) 21:51:41 - hyd 試料の凍結融解が原因じゃないですかね。阻害剤加えてても、止まる保証はないし。blotするだけなら、最初からSDSバッファーで可溶化して凍結してた方が良いです。それとも分注して保存するとか。 一つだけ書かれたので気になるのは、アプライするときのCHAPSとSDSのモル比が１：１くらいになってそうなこと。だいたい大丈夫みたいですが、SDSの割合をもっと高くした方が無難です。過剰量ないとタンパクに結合するSDSの量が少なくなるかもしれません。

プロテアーゼインヒビター・・・ 削除/引用 No.3326-9 - 2010/10/08 (金) 20:05:25 - SU 試料は最終的にPBSに溶解させて冷凍庫で保存してます。 電位泳動の前に解凍させ、Laemmli's sample bufferに加えています。 プロテアーゼインヒビターはCHAPS cell extract bufferに入っています。 実は一番最初の実験では すべての目的のタンパク質が検出されたのですが、 再度実験を行ったところ検出されなくなりました。 抗体を新しくしてみたり、 試料やsample bufferを新しく調整して実験を行ってもダメで、、、 抗体は成功した時とまったく同じものなので問題ないと思います。

ゲルの問題；； 削除/引用 No.3326-8 - 2010/10/08 (金) 19:33:06 - SU おおさんご指摘ありがとうございます。 スタッキングゲルは使ってないんです。 トランス後のゲルをCBB染色液で染色してますが、 泳動は特に問題ないと、、、（思いたいです；；） タンパク質の分解は試料の作製段階で起こることで、 sample bufferは特に問題ないことになるのでしょうか。 試料作製段階での問題だとすれば、 超音波ホモジナイザーなどは使ってないので 試料作製時に用いた試薬に問題がありそうですね；；

(無題) 削除/引用 No.3326-7 - 2010/10/08 (金) 17:49:10 - in situ 10%アクリルアミドゲルだったら、35kDのタンパク質が分離できないってことは多分ないと思います。 やっぱり、サンプル調整中にタンパク質が分解しているのか… プロテアーゼインヒビターはlysis buffer中に加えていますか？ あと、抗体がちゃんとウエスタンでworkするという確証はありますか？ たまに駄目な抗体だと、dye front付近の分解産物に非特異的にくっついて、目的のものは認識していないとかもあると思います。

(無題) 削除/引用 No.3326-6 - 2010/10/08 (金) 17:42:16 - おお >ゲルの組成は >Acrylamide 33%(v/v) >lower buffer(1.5M Tris-HCl,0.4% SDS) 25%(v/v) >50%(v/v)glycerol 13%(v/v) >DDW 28%(v/v) >10%(w/v)APS 0.67%(v/v) >TEMED 0.06%(v/v) スタッキングゲルはつかってないのですか、、、

(無題) 削除/引用 No.3326-5 - 2010/10/08 (金) 17:38:47 - おお ゲルが完全に重合してなかったのかな。

(無題) 削除/引用 No.3326-4 - 2010/10/08 (金) 17:33:27 - おお マーカーはちゃんと流れてるんですよねぇ、、、 多分なと思いますが蛋白質のｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎの可能性はどうでしょうか？ CHAPS cell extract bufferはＰＩＰＥＳを使っているようですが、、、 トリスーグリシンのシステムでは大丈夫だったと思いますが、、、 いま、泳動バッファーのシステムが多様化してますので気になるところです。 トランスファーした膜をアミドブラックなどでそめると、 泳動じしんが悪いかなどの情報がもっと得られると思います。

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