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(無題) 削除/引用 No.3321-13 - 2010/10/08 (金) 13:42:53 - S.W 　APさんへ glycerol stockのなかにあるていど、あるmutationをもつ細胞が含まれていれば、培養の初期から一緒に増殖してくるので、シングルコロニーを拾うのがめんどくさくても、液体培地の無制限の植え継ぎはしてはいけないとのことですが、 僕の中で、液体培地と固形プレート培地での菌体の育成様式の違いが分かっていません。ですので、液体培地での植え継ぎをしても、植え継ぎをせず single isolation をしてもmutationは同じ割合で入ってくるのではないでしょうか。いかがでしょうか。

(無題) 削除/引用 No.3321-12 - 2010/10/08 (金) 13:30:38 - S.W 　S.W です。 　Pumpkin さんすみません。今更ながら、3321-4 での投稿で、まさか1個ではないですよね。とタイプされてましたが、そのまさに1個です。こういう状況では isolation の意味はないのでしょうか。

(無題) 削除/引用 No.3321-11 - 2010/10/08 (金) 13:07:30 - AP >ただ、三個ストックから取って、そのうち1個が望んだplasmid を継承しない時点で、single cell isolation をしてもコンタミやplasmid の脱落を防ぐことはできなかったということになります。ですので、single cell isolation という操作そのものに良からぬことを回避することはできないし、つまり single cell isolation をすることにそれほども意味もないということにはならないでしょうか。 引用が長くなりましたが、 mutationとかcontaminationが起こるタイミングと、増殖・プラスミド精製にいたるまでの世代数を考えれば、意義は自明ではないでしょうか。 正しいプラスミドをもつ一個の細胞が、コロニー形成をへて、プラスミド精製に向けての培養までのあいだにmutationが起こったとしても、全体の細胞から見れば、たとえば数万分の１とか、非常に低い存在率ですから無視できます。 しかし、たとえばglycerol stockのなかにあるていど、あるmutationをもつ細胞が含まれていれば、培養の初期から一緒に増殖してくるので（で、しばしばmutationを起こした方が増殖が早かったりする）、mutantの画分が無視できなくなるでしょう。 そういうことがあるので、シングルコロニーを拾うのがめんどくさくても、液体培地の無制限の植え継ぎ（一度培養した液を、新しい培地に植えて殖やすの繰り返し）は禁忌なのです。

(無題) 削除/引用 No.3321-10 - 2010/10/08 (金) 13:01:30 - cDNA 実際の話ですが、ウイルスベクタープラスミドは、大腸菌を使って増やすと、プラスミド内の組み換えを高い頻度で起こして、小さなプラスミドに変わってしまいます。 マキシプレップをして電気泳動で単一のように見えても、組換わったプラスミドは少し混じっています。マキシプレップDNAを使い切って、もう一度大腸菌で増やす際、シングルコロニーを取り直さないと、小さくなったプラスミドの方が増殖が速くて、マキシプレップすると小さいプラスミドがほとんどになります。 これは極端な話ですが、通常のプラスミドでも変異は低頻度ですが入りうるので、シングルコロニーを取った方が良い、でもごく低頻度だから、まぁシングルコロニーを取っておけばマイナーな変異は入ってこないだろう、ということではないでしょうか。

(無題) 削除/引用 No.3321-9 - 2010/10/08 (金) 13:00:56 - Pumpkin いやいや、あるコンストラクトを作って、それをもっている形質転換体を得て増やしたものをストックしたとしますよね。仮に100個の大腸菌がいたとして、1個だけ変異したと。後日必要になって起こす時に３個シングルプレップしたとして、たまたまこの１個由来のクローンを拾ったとします。このおかしなクローンを使うとコンストラクトが違うわけですから最悪あなたの実験は失敗します。しかし、あと２つのクローンはもとのクローンと同じだったのでこちらを使うことにし、目的の実験ができました。 これで、「よからぬこと」を回避しましたよね？ ちなみに中年さんへの質問にも手を付けますが、 >良くてその稀なイベントがそのままの割合で持ち込まれる わけですが、培養中にどちらが優先になって増幅されるかわからず、へたすれば「よからぬ連中」だらけになることだって考えられますよ？ リスクマネージメントなんですよ。

(無題) 削除/引用 No.3321-8 - 2010/10/08 (金) 12:36:40 - S.W 　S.W です。中年さんへ single colony isolation無いまま培養をすると、良くてその稀なイベントがそのままの割合で持ち込まれるとのことですが、もし創であれば、single cell isolation をしてもストックと同じ割合で稀有なイベントが起こるのではないでしょうか。いかがでしょうか。

(無題) 削除/引用 No.3321-7 - 2010/10/08 (金) 12:34:20 - S.W S.W です。Pumpkin さんへ 　すみません。single はPunpkin さんがおっしゃる通り、一個というわけではありません。ただ、三個ストックから取って、そのうち1個が望んだplasmid を継承しない時点で、single cell isolation をしてもコンタミやplasmid の脱落を防ぐことはできなかったということになります。ですので、single cell isolation という操作そのものに良からぬことを回避することはできないし、つまり single cell isolation をすることにそれほども意味もないということにはならないでしょうか。

(無題) 削除/引用 No.3321-6 - 2010/10/08 (金) 12:25:17 - 中年 No.3321-3のコメントについてですが、「よからぬこと」というのが稀なイベントであるというのが前提です。 single colony isolation無いまま培養をすると、良くてその稀なイベントがそのままの割合で持ち込まれますし、悪くするとそちらが本来のプラスミドより増えが良くてそちらを多く含むことになる可能性すらあります。 single colony isolationをすると、少なくともスタート時点においては「よからぬこと」を起こしていないクローンからスタートできることになります。よほど運が悪ければ、「よからぬこと」を起こしたクローンを選んでしまって、得られたプラスミドはすべてそちらになってしまうこともありますが、その場合ですら全てが「よからぬもの」なので、原因究明はむしろ容易になるでしょうね。

(無題) 削除/引用 No.3321-4 - 2010/10/08 (金) 12:20:56 - Pumpkin いや、だからシングルをピックするんですよね。 まさか、シングルピックのときに本当に1個しかとらないということでしょうか。3個位拾って、元と同じだということを確かめれば、1個がおかしくても正しいものを継承していけますよね？

(無題) 削除/引用 No.3321-3 - 2010/10/08 (金) 12:17:23 - S.W 　S.W です。 　もしストックに保存していた時点でコンタミなどの良からぬことが起こっているのなら、single cell isolation でも同一の現象が起こるのではないでしょうか。ですので、良からぬことが起こっている可能性がある限り、いくら培養してもよからぬことは起こり続けるのでは？ その点はいかがでしょうか。なにか、からくりがあるのでしょうか。よろしくお願いいたします。 以前の投稿も確認します。

(無題) 削除/引用 No.3321-2 - 2010/10/08 (金) 11:59:29 - Pumpkin 単純な答えの一つは、例えばあるplasmidを持つ大腸菌のクローンをストックしていたとして、再び起こしてplasmid調製をするとします。このときのクローンは全て同一のクローンであることが期待されるわけですが、保存中に「よからぬこと」（例えばプラスミドの脱落（まぁ、これは許容されるんですが）、変異）が起きる危険性があるので、それだけを考えてもシングルをピックアップする必要があります。 また、何らかの要因でコンタミが起きていたとしてもシングルからのピッキングであればこれを回避できます。 その他にも最近トピックにあったような。 過去ログも参照してください。

single cell isolation をする本当の意義は？ 削除/引用 No.3321-1 - 2010/10/08 (金) 11:20:45 - S.W 　どうしても分からないことがあります。plasmid 精製前の大腸菌のsingle cell isolation をする本当の意義は何なのかということです。良く言われている答えは 混じり物があるから なんですが、混じり物は何なのか調べたり聞いたりしたのですが、よく分かりませんでした。当初は F' エピゾームのことかなと思っていたのですが、話が矛盾してしまってうまく説明できないので、これも違うと思っています。 ご存知の方よろしくお願いいたします。

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