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(無題) 削除/引用 No.3318-4 - 2010/10/10 (日) 10:02:35 - とおりすがり 私も同じような経験があります。 私の場合はプライマー配列変えたらワークするようになりました。 違うサンプルどころか同じcDNAでもrunごとにバンド強度変わったりしてかなり困りましたね。 他の遺伝子はn=3でもほとんどばらつかないのに何でだろ？って感じで。

(無題) 削除/引用 No.3318-3 - 2010/10/08 (金) 16:54:57 - み あなたが行われている半定量PCRとはどのような手法ですか？ 何サイクルで出る出ないという結果になっているのか？ プロダクトサイズは小さい方が安定してかかりますよね。 その辺も大丈夫ですか？ 理論的に考えて出ないのはあり得ないのなら、元々のRNAサンプルの精度にバラツキがあるのか、cDNAに逆転写する際にバラツキが出たのか・・・。 PCR条件のシテキ化がされていないのかも。アニーリング温度やプライマー配列などの問題で、かかるかからないの微妙な所で勝負しているだけなのか。単に腕の安定性がないのか。 （actinやgapdhで均一にかかったからと言われても・・・。アバンダントな遺伝子に関しては下手でも余裕でかかっているだけとか） 実験結果は実験結果としてしっかり評価して、次にそれが真実を反映しているかどうかをしっかり考えてください。今回の場合は実験そのものが評価するに値するものなのかどうかをまず考えないといけないわけですよね。 上手い人があなたの実験を横で見ていたら、単に「腕磨け」と言われて終わりかもしれないし。 頻繁にPCRの再現性に関するトピが立てられますが、この種の実験は単に下手でかかるかからないという結果になっても不思議には思わない。基質がどれだけ存在して、それにプライマーがどのくらいの特異性でどのくらいの頻度でアニールするかにかかっている非常に不確定要素を含む実験系だと思うのです。

(無題) 削除/引用 No.3318-2 - 2010/10/08 (金) 13:10:37 - Pumpkin PCR初心者さん。。。 それを考えるのがあなたの仕事で、ポジコンやネガコンなどの結果、さらにはGAPDHの結果などを勘案してPCRが正常にワークしているのだとしたら、その解釈こそが半定量PCRにあなたが求めている実験結果そのものなのではないでしょうか？ 言っている事がわかるでしょうか？

半定量PCRについて 削除/引用 No.3318-1 - 2010/10/07 (木) 20:00:21 - PCR初心者 いつもお世話になっております。 あるホルモンを濃度を振って添加したときの、 ある遺伝子(Aとします)の発現を定量する為に半定量PCRを行なっています。 しかし同じ抽出方法を行なったにも関わらず、あるサンプルにはバンドが出る一方で、 他方のサンプルでは全くバンドが出ない、という結果になっています。 GAPDHはきちんと取れています。また同じサンプルで別の遺伝子(B)を増幅させた場合には きちんと定量できています。 この結果についてどのように解釈すれば良いのでしょうか？

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