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(無題) 削除/引用 No.3315-6 - 2010/10/07 (木) 17:27:47 - cell ご回答ありがとうございます。 stuさん> セレクションは可能です。しかし分化誘導をかけてから徐々にGFP発現してくるものなので、継代維持している間はどのように変化しているのかは見当もつきません。そして継代を重ねたことに直接起因するのかは定かでないですが、GFP発現が下がったという状況です。ちなみにGFP発現はゼロではありません。ただ発現効率が下がったという感じです。 あさん> 私も同様に分化能の低下から来るものだと考えています。しかし、以前起こした細胞と同様のものを使ってもGFP発現が異なっていたことがあります。まだ経験が浅く注意深く見ていなかったのですが、GFP発現が大きく異なったことから、継代の際にちゃんとセミコンフまで培養せずに継代してしまったことが原因の一つではないかと考えています。 ノックインしたGFPの発現自体が下がっていないかというご指摘ですが、確かにその方法で調べれば分化効率自体が下がったか直接調べられるのですが、今回用いているGFPと同様の抗体で適切に染色できるものが無くしっかりと調べられないというのが現状です。

(無題) 削除/引用 No.3315-5 - 2010/10/07 (木) 17:14:50 - あ GFPカセットがサイレンシング／除去されている可能性に同意ですが、あと、継代を続けたせいで細胞の分化能自体が下がった可能性はありませんか？ 分化マーカーは発現するが、GFPだけ発現しないのでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.3315-4 - 2010/10/07 (木) 17:02:51 - stu 原因ははかりませんが、同僚がトランスジェニックマウスからGFP-Xを発現する繊維芽細胞を不死化して培養しておりますが、じょじょにGFP発現がなくなってしまい困るそうです。 やはり外来遺伝子がゲノムに組み込まれることは、何らかの方法で異物と認識され除去、もしくはサイレンシング（CAGだから）されてしまうのかもしれません（培養環境によって？）。トランスフェクションなどで導入した薬剤セレクションできる場合は問題ないのですが。 cellさんのGFPはノックインなのでセレクションはできないのでしょうか？セレクションしてもなくなってしまうということなんでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.3315-3 - 2010/10/07 (木) 14:58:39 - cell おおさんご回答ありがとうございます。 現在はマウスES細胞で実験をしています。幹細胞実験自体初めてなので原因がさっぱりわかりません。いまは新しく細胞を起こし直しているのですが、それで成功したとしても理由がはっきりしないと気持ち悪く、継代でもGFP発現が左右され得るものかを知りたいと思っていました。

(無題) 削除/引用 No.3315-2 - 2010/10/07 (木) 13:43:57 - おお 継代で徐々にかわったのだと思いますが、お示しの事が原因かは わかりません。幹細胞はなんの幹細胞でしょうか、エンブリオニック なのか、神経幹細胞みたいなものなのか、、、 また、細胞により最適継代条件もちがうので、いつもおしめしのような 継代がいいとも限りません。 パーフェクトとおもわれる条件で継代していても細胞は徐々に変わってくることがあります。 継代数の若いストックをおこし、そのストックが少ないならストックをふやしておいて、 使用に耐えれる細胞を使うべきだと思います。 あと１００％細胞側に原因があると言い切れるでしょうか？ そこも考えておかないと泥沼にはまってしまうかもしれません。

細胞の継代 削除/引用 No.3315-1 - 2010/10/07 (木) 11:55:57 - cell はじめまして。最近培養細胞を扱い始めた初心者です。 基本的な質問になると思うのですが、細胞を継代するタイミングはセミコンフルエントの状態だと認識しています。それが万一、セミコンフにも至っていない50-60%ぐらいの状態で毎回継代を続けていたとしたら細胞の状態はどのようになっていくのでしょうか。 現在、GFPノックインされた幹細胞で実験をしており、目的細胞へ誘導を続けていくと徐々に光るようなGFPが組み込まれています。以前はよく光っていたのですが、最近は以前にも格段とGFP発現が下がっています。原因として上記のような理由から極端なGFP発現の低下が考えられるのでしょうか。それとも他にも原因があるとしたらどのようなことが考えられるのでしょうか。 どなたか原因が分かる方がいたらアドバイスお願いします。

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