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(無題) 削除/引用 No.3312-5 - 2010/10/08 (金) 03:45:06 - なおき amiさん コメントありがとうございます。 確かにDMSOのみを加えたコントロールというのは置いていませんでした。 また、反応の温度が低い方が良いということで、一度試してみたいと 思います。その点からしても反応を止めるFCS入りのmediumも冷たい方が 良い気がしましたので、次はそうしてみたいと思います。

(無題) 削除/引用 No.3312-4 - 2010/10/07 (木) 19:15:30 - ami ＞ unstained control unstainedというか、、PBS+DMSOで同じ時間インキュベートした場合に大丈夫かどうかというか、、 5分はいいですけど、37度ってきつくないですか。RTでもいいと思います。

温度など 削除/引用 No.3312-3 - 2010/10/07 (木) 13:15:07 - なおき amiさん unstained controlも培養を続けていますが、そちらは特に問題ありません。 染色時の温度は37度でincubatorに入れています。染色前にsuspendするRPMIも37度に温めています。 反応時間は5分としています。

気になるのは 削除/引用 No.3312-2 - 2010/10/07 (木) 10:06:17 - ami CFSEで染めないと死なないのか、というControlが必要 染色時の温度と時間が決定的に重要ですが、その情報がありません

CFSE 削除/引用 No.3312-1 - 2010/10/07 (木) 00:53:23 - なおき いつも参考にさせていただいております。 血液系（浮遊細胞）のcell lineをCFSEで染めてそれをtarget cellと して細胞傷害活性を評価する系を始めましたが、 CFSEで染めると結構細胞が死んでしまうという 問題があり相談させていただきました。 最初のCFSE濃度設定においては2μM〜5μMで染めても 大差なく染まり、その後は2μMで行うようにしました。 その後の実際の細胞傷害活性測定時には同じように行っても どうも細胞が死んでしまいます（negative controlにおいても）。 少し時期が経っているので細胞自体が弱ってきている 可能性もあるのかもしれませんが、まだ1ヶ月程です。 また、実際の測定時に細胞数を減らしていることも影響しているかもしれません（現在total 1x10^6/mlで行っています）。 文献によっては細胞数が少ない場合にはFCSを5%加えたり する方が良いと書いてあるものもあります。私自身は CFSEの染色を阻害する側面もあるのではと思ったりしています。 これまではRPMIをserumなしで用いています。 別の文献ではPBSの方が良い可能性があるとも書いています。 上記の条件設定を試されたことのある方がいらっしゃったら コメントいただければありがたいです。 また、CFSEの反応を止める（incubationの後）時に今は RPMI/10%FCS（室温）を用いていますが、FCSをそのまま用いている 場合もあるようです。また冷やしたRPMI/10%FCSを使うという 場合もあるようです。さらには希釈した後しばらく静置するという ものから、すぐに遠心するというものまであり、どこを 検討していけば良いのかと思っている次第であります。 温度なども含めてこちらに関しても検討されたことが あればコメントいただければありがたいです。 どうぞ宜しくお願いいたします。

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