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(無題) 削除/引用 No.3302-5 - 2010/10/07 (木) 23:38:59 - サテライト >[Re:3] おおさんは書きました : > ｅｘｔｅｎｔｉｏｎの長さを長めにとり、十分な長さのＤＮＡが > えられるようにする（５００ｂｐなので３０ｓは妥当ですが > 余裕をもって６０ー９０ｓくらいにせっていする３、４回のリピートがありうるときは > もっとながくしてもいいと思います）とどうでしょうか。 > あとはもしかしたらプライマーの量をおおくするといいかもしれません。 > > りぴーと回数がわかった細胞はおもちですか？ おお様 書き込みありがとうございます。 リピート回数についてですが、恐縮ながら正確な数は把握しておりません。ただし、論文でみたことがある回数は20,000リピート以上あるという記載をみたことがあります。転写産物として何リピート分まで読まれているかは私は判らないのですが、Extention timeを長くすればする程、複数リピート分の長さに相当するバンドが得られるようになるのではないかと思います。 プライマーの量を増やすとのことですが、これは試したことが有りません。早速一度どの様な変化がみられるか調べてみたいと思います！ この改善策を思いつかれた理由を教えていただきたいのですが、これはリピート配列故に、プライマーの量に不足が生じてばらつきが大きくなるのを防ぐためという解釈で宜しいでしょうか？ 引き続き宜しくお願い申し上げます。

(無題) 削除/引用 No.3302-4 - 2010/10/07 (木) 23:32:29 - サテライト ah様 書き込みありがとうございます。 マルチプレックスPCR、Long PCRの条件を参考にとのことですが、いずれも不勉強のため詳細を把握しておりません。早速調べてみます。 原因の解説をしてくださり、ありがとございます。最初に違う長さのものが増えてしまうことで、PCRが終わる頃には随分な差が出てしまっているのだろうかなどと漠然と考えていたのでとても参考になりました。ありがとうございました。 因に仰る通り、長い方だけが増えたことはありません。リピート数の多い方即ち長い方のバンドはいつも薄く、短い方のバンドがいつも濃い傾向にあります。

(無題) 削除/引用 No.3302-3 - 2010/10/07 (木) 22:46:25 - おお ｅｘｔｅｎｔｉｏｎの長さを長めにとり、十分な長さのＤＮＡが えられるようにする（５００ｂｐなので３０ｓは妥当ですが 余裕をもって６０ー９０ｓくらいにせっていする３、４回のリピートがありうるときは もっとながくしてもいいと思います）とどうでしょうか。 あとはもしかしたらプライマーの量をおおくするといいかもしれません。 りぴーと回数がわかった細胞はおもちですか？

(無題) 削除/引用 No.3302-2 - 2010/10/07 (木) 19:53:33 - ah PCRでは、どうしたって短い分子が優先的に増えてしまうことがままあります。その差が小さければそれほど問題ではないですが、250 bpもあればそのようなことがあっても不思議ではありません。最終的に何本のバンドが増えるかは、PCRの初期に長い分子が偶発的に増えるかどうかの、運にかかっています。長い方だけが増えたという経験が無ければ、おそらくこれが原因でしょう。マルチプレックスPCRとかlong PCR条件を参考にすると、改善されるかもしれません。

Major satelliteのPCR 削除/引用 No.3302-1 - 2010/10/05 (火) 23:35:19 - サテライト いつも勉強させて頂いております。 トピック名にも示しましたが、現在Major satellite配列のPCRを行っております。 直面している問題としましては、論文のプライマーと同じ配列を用いているのですが、その都度バンドパターンが変わってしまうということです。 Major satelliteは約250 bpの配列のリピートとして認識しております。このリピート両端にアニールするprimerを用いてPCRで増幅すると、250 bpの倍数の長さのバンドが生じると思います。 私が抱えている問題はこの複数のバンドの本数が毎回異なってしまうということです。 例えば１回目のPCRでは２リピート分のバンドと１リピート分のバンド、それぞれ500 bp, 250 bpのバンドが２本出たのに対して、２回目は１リピート分の１本でした。さらに３回目のPCRでは１回目同様に再び２本のバンドが現れた。という状態です。 使用しているプライマーの配列は以下であり、Current Biology, Vol. 13, 1192–1200, July 15, 2003,を参考にしました。 Fw 5'-GACGACTTGAAAAATGACGAAATC-3' Rev 5'-CATATTCCAGGTCCTTCAGTGTGC-3' 実験の内容の詳細を示します。 マウスのES細胞のcDNAを調製し、上記のプライマーを用い、Ex-TaqでRT-PCRを行っています。 PCRのプログラムは 95℃ 2 min 95℃ 20 sec 60℃ 30 sec 68℃ 45 sec 4℃　Foreverで　サイクル数は30サイクルにしています。 この条件はMajor satelliteのクローニングの際に条件検討をして最も良かった条件だったので使用しています。 以上どなたかお知恵をお貸しください。宜しくお願い致します。

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