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DNAの量を増やす方法 トピック削除
No.3301-TOPIC - 2010/10/05 (火) 18:07:07 - nunny
DNAのある配列を、制限酵素サイト付のプライマーを用いてPCRを行うという操作を行っています。アニーリング温度、バッファーの組成など、思いつくことは試したのですが、PCRをしても非常に薄いバンドしか出ません。
そこで、PCRチューブ32本分PCRを行い、PCR産物をひとつにまとめてPCRpurificationすることにしました。が、容量が大きいため、100μLずつ分注し、バインディングバッファーに溶かしてから、ひとつのカラムに通す作業を繰り返すことで精製を行いました。精製後、電気泳動を行うと、非特異的なバンドが非常に濃くなり、肝心の欲しいサイズのDNAは薄いバンドのままでした。その後、ゲルカットを行い、濃度を測ったところ、２ng/μLしかなく、次の処理を行えないでいます。
増やしたいDNAのサイズは130bpです。
何か手立てはありますでしょうか？
文章に不備がある場合はご指摘ください。
よろしくお願いします。
　
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(無題) 削除/引用
No.3301-10 - 2010/10/06 (水) 11:46:57 - nunny
みなさま
ご返信本当にありがとうございます。
恥ずかしながら私の知らない手法がたくさんありましたので、今後の勉強も兼ねてこれから一つづつ試してみたいと思います。

(無題) 削除/引用
No.3301-9 - 2010/10/06 (水) 03:10:34 - おお
130bp合成しちゃえば。。。

(無題) 削除/引用
No.3301-8 - 2010/10/05 (火) 22:25:13 - ポスドクT
自分もnnnさんのようにNestedで釣るのが良いと思います。

あと考え方を変えて、
鋳型自体をチェンジするという手もあります。

自分は数キロ〜十数キロを釣る時にBACを使用しています。
この方法で釣れないことはまずありません。
今時、B6 BackのBACは簡単に手に入りますので、
どうしても上手くいかない時にはトライする価値ありです。

(無題) 削除/引用
No.3301-7 - 2010/10/05 (火) 22:04:11 - nnn
Nested PCRも、いかがでしょうか？
目的の130bpよりも少し広い範囲に、別のプライマーを設計して1stPCRを行い、
今使っているプライマーで2ndPCRを行う。

気になる点は、PCRの酵素はなんでしょう？
私でしたらクローニングにはTaq DNA polymerase は使わずに、
増幅効率も良く、正確性も高いDNA polymerase
（Prime STARや、KOD ver2 + DMSOとか）を使っています。

もし70-80bpのDNAを合成する場合は、化学合成ミスがおこりえるので、
PAGE精製をしたほうがいいと思います。

もし精製の一週間ほどを待てないならば、
35bpくらいの短いプライマーを4ペアぐらい（合計8本）脱塩グレードでも合成し、
PCRを4回行って、どんどん伸ばしていくという方法もありますかね。
もちろん、目的のDNAの配列によっては（反復配列などがあると）残念ながら出来ない方法ですが。

電気泳動で出たバンドを 削除/引用
No.3301-6 - 2010/10/05 (火) 20:29:09 - ami
ピペットチップでつんつんして、それを水で洗って、その水をテンプレートにしてPCR。

(無題) 削除/引用
No.3301-5 - 2010/10/05 (火) 18:51:17 - 中年
長いプライマーを合成して鋳型無しでPCRする、に私も一票

(無題) 削除/引用
No.3301-4 - 2010/10/05 (火) 18:33:04 - 774
流動・・・
すいません。泳動。

(無題) 削除/引用
No.3301-3 - 2010/10/05 (火) 18:30:32 - 774
サイクル数を増やす。

アニーリングをサイクル数が進むに従って下げていく。

最初の薄いバンドのPCR productを希釈したものをtemplateにしてもう一度PCRをかける。

電気流動したバンドを切り出して、それをtemplateにしてPCR。

できることはたくさんあります。

(無題) 削除/引用
No.3301-2 - 2010/10/05 (火) 18:21:35 - 774
切り出したDNA断片が目的の物だったら、これをTemplateにしてもう一度PCRをかけてみると上手くいくかもしれません。

PCRで増幅されていないようですので、確認ですが、
Templateは目的の配列を確実に持っていますか？
Templateは十分に精製されていますか？

その辺が問題なくて、PCRの条件をどんなに振ってもダメだったら、
中央に重なりができるにような長いプライマー(7~80bp)を設計して、
適当なpolymeraseで伸長させるという方法もありかと。

DNAの量を増やす方法 削除/引用
No.3301-1 - 2010/10/05 (火) 18:07:07 - nunny
DNAのある配列を、制限酵素サイト付のプライマーを用いてPCRを行うという操作を行っています。アニーリング温度、バッファーの組成など、思いつくことは試したのですが、PCRをしても非常に薄いバンドしか出ません。
そこで、PCRチューブ32本分PCRを行い、PCR産物をひとつにまとめてPCRpurificationすることにしました。が、容量が大きいため、100μLずつ分注し、バインディングバッファーに溶かしてから、ひとつのカラムに通す作業を繰り返すことで精製を行いました。精製後、電気泳動を行うと、非特異的なバンドが非常に濃くなり、肝心の欲しいサイズのDNAは薄いバンドのままでした。その後、ゲルカットを行い、濃度を測ったところ、２ng/μLしかなく、次の処理を行えないでいます。
増やしたいDNAのサイズは130bpです。
何か手立てはありますでしょうか？
文章に不備がある場合はご指摘ください。
よろしくお願いします。
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