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(無題) 削除/引用 No.330-10 - 2009/04/17 (金) 11:11:29 - DSC 話を初めに戻したいのですが。 質問の内容は２つの違った意味に解釈することができます。 「イントロンを挟む位置にプライマーを設計する」とは 次のどちらの意味で書かれたのでしょうか？ （１）遺伝子（ゲノムDNA）配列上で、増幅したいエクソン部分から イントロンを挟んで離れているエクソンの配列上にプライマーを設計する。 例えばcDNA上のエクソン3相当部分を増幅したいとき、 センスプライマーはエクソン2に、 アンチセンスプライマーはエクソン4に設計する。 cDNA上ではプライマー間が近いのに対し、ゲノムDNA上では プライマー間の距離が遠いために、伸長時間を適切に設定することにより cDNA配列のみを効率よく増幅させる。 （２）遺伝子（ゲノムDNA）配列上で、複数のエクソンに跨がる位置に プライマーを設計する。 例えば、センスプライマーは5'側がエクソン1、 3'側がエクソン2に相当する配列で スプライシング後の配列に相当するように設計する。 cDNA上では連続しているがゲノム上では分断された配列を 標的としたプライマーを用いることで、 cDNA配列のみを効率よく増幅させる。 私は（２）の話だと思ったのですが、 下を読むと（１）と解釈されている方が多いようです。 > けど、感じの悪い文章を書くのはいかがなものかと思いました。 ここでは、質問の内容があまりに初歩的で、 成書やWebを探せば簡単に答えが見つかるはずなのに 明らかにその努力が足りないと思われるものには それなりの回答が付けられることがあります。 ここにレスを付けておられる方々の多くも 書籍やWebでは答えの見つからない難易度の高い質問には 真摯な回答を寄せられる方ばかりです。 ここでも質問の内容に相応なレスが付いていると思います。 私が書くことでもなかったとは思いますが、、、

(無題) 削除/引用 No.330-9 - 2009/04/17 (金) 09:22:13 - 野球犬ミッキー みなさん、わかりやすい御説明ありがとうございます。 この手のプライマー設計に慣れていないので、わかりやすく 教えて頂きましてありがとうございました。 けど、感じの悪い文章を書くのはいかがなものかと思いました。

(無題) 削除/引用 No.330-8 - 2009/04/16 (木) 17:42:44 - DSC >[Re:6] ザンギさんは書きました : > 経験豊富な諸兄にとっては単なる屁理屈かもしれませんが、イントロンを挟めば現実的にはゲノム配列は増えにくいけども原理的に増えないということではないので、PCR実験の経験のない方には理解しずらいのではないですか？ おおさんが書かれている他に、私は下記のことが気がかりです。 文章での説明ではわかりづらい内容かもしれませんが。 RT-PCRに2つのエクソンにまたがる設計のプライマーを用いた場合、 プライマーの3'側だけで内側エクソンの配列に十分アニールできるならば、 ゲノムの配列が増幅されてしまいます。そうならないように 内側エクソンにかかる部分が長くならないように配慮しますが、 あまり短くし過ぎると、今度は5'側でゲノムの外側エクソンにアニールして 3'側がPCR酵素のProofreading活性で一旦削られ、 外側エクソン間での増幅産物が生じてしまう可能性があります。 イントロンを跨いだ先のエクソンの配列がいくらかでも ゲノム上で連続しているイントロンの配列に類似しているという場合も 内側エクソン+連続するイントロンにmisanealingして ゲノムからの増幅産物が生じそうです。 「杞憂」と思われるかもしれませんが、 そうとしか解釈できない結果が得られたことがありました。 そうなると、「DNAの分解が不十分だった？」「RTがうまくいっていない？」 「もともと転写物がないor少ない？」「PCRの条件が不適切？」など、 オリゴの設計以外にもいろいろ考えさせられることになります。 いろいろ考え始めるときりがありませんが、 この手のプライマーの設計には少し気をつかいます。 内側・外側エクソンに単純に半々ずつかかるようにしてOKな場合もありますが、 内側エクソンにかかる部分は1/3（長さで8-10nt）くらいで設計し、 その部分が外側エクソンに連続するイントロンと 類似性がないことを確認するようにしています。

(無題) 削除/引用 No.330-7 - 2009/04/16 (木) 15:45:38 - おお >[Re:6] ザンギさんは書きました : > 経験豊富な諸兄にとっては単なる屁理屈かもしれませんが、イントロンを挟めば現実的にはゲノム配列は増えにくいけども原理的に増えないということではないので、PCR実験の経験のない方には理解しずらいのではないですか？ あ、そうか。DNaseI処理というのは実験の感覚てきなものはありますね。 イントロンをはさんでない短い領域ではしっかり処理しないと (完全に消化されず)バンドが出てしまうことがあります。 イントロンがあるとそのぶんDNaseで分断される確率が 高くなるわけで、さらに、長いPCR産物は増えにくいので 結局増えないといって良いほど効率が悪くなります。 違う見方をすれば、電気えいどうでバンドを見る場合だと、 イントロンを含んだゲノムのバンドがみえても、バンドの位置が 違うのでmRNA由来かどうか区別がつくとい考えで実験する人が いますね。短いイントロンだったらそういうこともあります。

(無題) 削除/引用 No.330-6 - 2009/04/16 (木) 14:26:45 - ザンギ 経験豊富な諸兄にとっては単なる屁理屈かもしれませんが、イントロンを挟めば現実的にはゲノム配列は増えにくいけども原理的に増えないということではないので、PCR実験の経験のない方には理解しずらいのではないですか？

(無題) 削除/引用 No.330-5 - 2009/04/16 (木) 03:39:27 - おお >[Re:2] TSさんは書きました : > はい!分からないです。 なぜ分からないか分からないです。

(無題) 削除/引用 No.330-4 - 2009/04/16 (木) 00:25:49 - CJ 増幅はされるでしょうね。 ヒント：増幅産物のサイズ

(無題) 削除/引用 No.330-3 - 2009/04/16 (木) 00:25:19 - ami PCRでゲノムは増幅されないというより、イントロンが入る分増幅されるDNA生産物の長さが長くなって、区別できるということだと思います。 > 分からない方、いますか？ 分からない人はほとんどいないと思います。

分からない方、いますか？ 削除/引用 No.330-2 - 2009/04/16 (木) 00:12:21 - TS

プライマーの設計について 削除/引用 No.330-1 - 2009/04/15 (水) 23:45:31 - 野球犬ミッキー RT-PCRのプライマーの設計について質問です。 イントロンを挟むようにプライマーを 設計すれば、cDNAサンプルにゲノムが混入してても PCRでゲノムは増幅されないと聞きましたが、 イントロンを挟むようなプライマーが、なぜ PCRでゲノムが増幅されないのか分かりません。 分かる方、教えて下さい。

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