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(無題) 削除/引用 No.3299-14 - 2010/10/06 (水) 03:07:09 - おお >[Re:10] 通りがかりさんは書きました : > プライマーのフォワードとリバースを混ぜて保存するとPCRが走らなくなる、という報告が最近どこかに書かれていたと思います。Fireさんのプライマー保存条件はどうでしょうか？ ありえなくもないですねぇ。 ホッとスタートで何とかならないもんなんでしょうかねそう言うのって。

(無題) 削除/引用 No.3299-13 - 2010/10/06 (水) 01:34:10 - A > プライマーのフォワードとリバースを混ぜて保存するとPCRが > 走らなくなる、という報告が最近どこかに書かれていたと思います。 面白い話ですね。以前cDNAライブラリーを買った際に付いてきたアクチン 用のコントロールプライマーはフォワードとリバースの混合物で送られて きて問題なく使えましたからおそらく配列に依存するのでしょうね。

(無題) 削除/引用 No.3299-12 - 2010/10/05 (火) 17:50:07 - 中年 プライマーを混ぜて保存するとダメになるという報告に興味があります。参考文献をご存じの方があったら教えていただけませんか。

(無題) 削除/引用 No.3299-11 - 2010/10/05 (火) 17:43:26 - Fire フォワードとリバースを混ぜて保存していました。 それが原因かもしれませんね。

(無題) 削除/引用 No.3299-10 - 2010/10/05 (火) 15:30:49 - 通りがかり プライマーのフォワードとリバースを混ぜて保存するとPCRが走らなくなる、という報告が最近どこかに書かれていたと思います。Fireさんのプライマー保存条件はどうでしょうか？ あと、PCR反応溶液中の酵素量がぶれていたりしませんか？たとえば、0.5ul酵素/tubeであれば、0.5ulを再現性良く加えることは難しいと思います。

(無題) 削除/引用 No.3299-9 - 2010/10/05 (火) 14:07:02 - み プライマー側の問題とは思えません。 たとえ室温で保存しているプライマーを使用したとしてもそのような事が起こる可能性は極めて低いと思います。 繰り返しになりますが 基質側のDNAサンプルを5倍希釈系列4ポイントくらい作成してかけてみては？ これは御自身でもコメントされてますが小さなサイズのプロダクト増幅時には起こりにくいということからも、DNA側に混入している不純物の持ち込みを減らすことで正常な増幅が見られるのではと考えてます。 あとはゲノムDNAは2回目に使用する際、軽くタッピングとかされていますか？たぶんDNA濃度が濃すぎて不均一または前述の不純物持ち込み量の問題だと思っています。

(無題) 削除/引用 No.3299-8 - 2010/10/05 (火) 13:36:53 - おお プライマーがわるくなった可能性はかなり低いと思いますが、否定はしません。 比較的かかりにくいプライマーで安定してかからないのかもしれません。目的によって対処方法が変わってくるので、それ以上コメント申し上げれません。

(無題) 削除/引用 No.3299-7 - 2010/10/05 (火) 13:10:32 - Fire まだ試していないことも多々あるので、お答えできないこともありますが、 PCRサイクルは35サイクルで、100ngほどのDNAを用いています。 別に注文したプライマーはサイズはいろいろですが、 3kbpほどのものの含まれており、異なるDNAを用いても同じような現象が起きます。 （２回目以降のPCRでは増えにくく、プライマーダイマーが見えるようになる） なので、プライマーがダメになってしまってるのではないかと思ってます。 ただ、１日後に-20℃で保管していたプライマーがダメになるとか考えにくいですし、 サイズの小さいPCR産物であればあまり問題なかったりするので、 一体何が原因かあまりわからないというのが実情です。

(無題) 削除/引用 No.3299-6 - 2010/10/05 (火) 11:24:36 - ぶん 一回目で増えたPCR産物を希釈して（1/100~1/1000ぐらい） おなじprimerでPCRをしたら掛かりますか？ 掛からないのならprimerに問題が、掛かるのならDNAに問題がある可能性が 高いと思います。 また、PCRのサイクルはどれくらいですか？ ゲノムはどれくらいの濃度をPCR反応液に入れていますか？ ゲノムが薄すぎてPCRを沢山回しているのなら（35サイクルとか） ゲノムとprimerの出会う確率で増える増えないが決まるので（出会いづらい） 結果が大きく変わります。 別に注文したprimerも3kbpぐらいを増幅するものでしょうか？ これも二回目は掛からなくなりますか？ ゲノムDNAを入れないサンプルでPCRすると同じようなprimerダイマーが出ますか？

(無題) 削除/引用 No.3299-5 - 2010/10/05 (火) 10:11:12 - Fire DNAは複数用意していますが、いずれも増幅しなくなりました。 しかしながら、また別のプライマーを注文してPCRをすると増えたりします。 プライマーが一番の原因ではないかと考えてますが、 注文してすぐに悪くなるとは考えられないので。

(無題) 削除/引用 No.3299-4 - 2010/10/05 (火) 09:40:37 - み ゲノムDNAの精製度がどの程度のものなのかわかりませんが、 DNA濃度が濃すぎたり、反応を阻害する物質の量が多かったりするとPCRはかかりにくいでしょう。 基質の希釈系列を作成してもいずれもかからないのでしょうか？ 3kbですか。下手な人がやれば、またはDNA側に前述のような問題があれば、かからなかったりかかったりするのは容易に想像つきます。 DNA検体は複数存在しいずれもかからなくなったのでしょうか？ 文面からはそのようには思えないからPCR試薬側の問題ではないのでしょうが。

(無題) 削除/引用 No.3299-3 - 2010/10/05 (火) 09:11:32 - Fire DNAはTE中に溶かして４℃で保存しています。 PCR産物の大きさは3kb程度です。実験の間は１日しか空いていません。 このようなことは以前にもあり、何か原因があるのではないかと思っているんですが、 他にどのような原因が考えられるのでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.3299-2 - 2010/10/04 (月) 23:18:52 - ぶん 一回目と二回目の間はどれくらい開いてますか？ ゲノムDNAはどのように保存していますか？（なににどれくらいの濃度で溶かして、何度で保存しているか） PCRの目的産物は何bpですか？ ゲノムDNAの保存の仕方または精製度が悪くて保存中に壊れてるのでは？ PCRで増やす長さが長ければ長いほどDNAが壊れた時に影響を受けやすいです。 増やすべきテンプレートが在る場合には起こらないプライマーダイマーが テンプレートがなくなったため、優先して起こっているのかも。 テンプレートDNAなしでPCRしたときに同じ事が見られるかもしれません。

ゲノムDNA PCR 削除/引用 No.3299-1 - 2010/10/04 (月) 19:32:57 - Fire ゲノムDNAを鋳型にしてPCRを行っています。 一度目にやった場合はきれいに目的のバンドがシングルバンドで増えるんですが、 二回目にやったときに一度目には見られなかったプライマーダイマーが多く見られ、 目的のバンドの増幅は見られませんでした。 新しくストックのプライマーを希釈してもこのような結果になってしまいます。 このような経験なされた方はいらっしゃいますか？ またどうしてこのようなことが起こるのでしょうか？ 何かご存知の方がいらっしゃいましたら教えていただけないでしょうか？

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