全13件 ( 1 〜 13 )　 前 | 次 　1/ 1. /1

(無題) 削除/引用 No.3297-13 - 2010/10/15 (金) 16:56:07 - トピぬし ゲノム量を少なくし，洗浄の条件をゆるくしてやってみたところ， 非特異バンドも2本出ますが，うまく検出できました。 皆様のご助言のおかげです。 ありがとうございました。

(無題) 削除/引用 No.3297-12 - 2010/10/08 (金) 13:07:20 - トピぬし >>中年さん ありがとうございます。 露光時間を長くしてみます。 >>APさん ありがとうございます。 制限酵素反応液に関してはあまり気にしたことがなかったのですが， 確かにどろどろだった気がします。 昨夜から今朝にかけてゲノムの量を減らして（５マイクログラム），制限酵素処理をしてみました。 以前よりもサラサラ感が増しているような気がします。 また，エチブロで染めたところ，前よりもサテライトのようなバンドがはっきり見えていた気がします（スメアの中にバシッと）。 今回は，もしかするとうまくいっているかもしれないです。

(無題) 削除/引用 No.3297-11 - 2010/10/06 (水) 15:14:14 - AP 訂正と補足 >プラスミドを1 くらいから数pgくらいまで段階希釈して、 単位が消えてしまいましたけれど、「1 ngくらいから数pgくらいまで」です。 >直接メンブレンにドットブロットしたものにたいして、 これをやるときは、一本鎖に変性する操作を忘れずに。アルカリブロットの条件で、ゲルブロット、ドットブロット両方やってしまえばいいです。 DIG（RIでも）ゲノムサザンでは、マウス・ヒトなどのゲノムDNA 1ugあればシングルコピーをそれほど難しくもなく検出できます。余裕をみて、数ugから10 ug使えば量的には問題ないはずです。 ゲノムDNAを制限酵素消化するとき、特に量が多いときは、液の粘性が高かったり、DNAがよく溶けきっていない、均質に懸濁していないことがよくあります。この状態では制限酵素が効きにくく、大部分が切れ残るというこあります。 10 ugを50 uLシステムで消化というのは、こういう状態であっておかしくないです。液の粘性を感じないくらい十分な体積で、制限酵素も多めにして消化すると良いと思います。また、消化が進んで粘性が下がってきたら、途中で一旦撹拌するとか酵素を足すとかすると、完全消化の助けになります。

(無題) 削除/引用 No.3297-10 - 2010/10/06 (水) 14:38:29 - 中年 コピー数が減ると検出感度が落ちるというより、理想的な実験条件であったとしてもシグナルはポジコンの1/2,500に過ぎないわけだから、ポジコンがサイズがわかるような濃さのバンドとして検出されるような感光（？）条件下では、サザンのバンドは見えないほど弱いはずということです。ポジコンが真っ黒な塊に見えるくらいまでもっと長焼きすれば、そのままでもサザンのバンドも見えるかも知れませんよ。

(無題) 削除/引用 No.3297-9 - 2010/10/06 (水) 13:58:23 - トピぬし 皆様 ありがとうございます。 やはりコピー数が減ると検出感度が落ちるのですか。。 多めのプラスミドに当たるからプローブは大丈夫かと思っていましたが。 少量での検討が推奨されるのですね。 あとはハイブリの条件もいじる必要がありそうですね。 さっそく取り掛かってみます。 また制限酵素ですが， 最終的には，ウシ以外の野生動物などの未知のゲノムに対してもサザンを行い，遺伝子の有無をウシと比較したいので，ORF内で切れる組み合わせで選んでいます。 本当は一つの制限酵素のほうが良いのでしょうが。

(無題) 削除/引用 No.3297-8 - 2010/10/06 (水) 12:21:58 - AP DIGはpgオーダーのDNAを検出する性能があります。 系の検証をするのであれば、プラスミドを1 くらいから数pgくらいまで段階希釈して、泳動→ブロットしたものと、直接メンブレンにドットブロットしたものにたいして、ハイブリ・検出をしてみたらいいと思います。これで、せめて10 pgくらいまで検出できていないと、本実験は難しいでしょう。また、ブロットや固定に問題があれば（これもありがちなケース）、これで見当がつきます。 PCRでの直接取り込みによるラベルは、配列や長さなどの条件を選び、どんなものでも常にコンスタントな性能のプローブが出来るものではないです。DIG標識ヌクレオチドの濃度を下げないと伸長が十分に行かないことも多く、しかし、そうすると比活性が低下します。いっそのこと、一旦普通にPCRした産物に対してrandom primeでラベルする方法をおすすめします。 ゲノムDNAがうまく消化されていないとしても、シグナルはでるはずですから、まずは検出系の検討でしょう。

(無題) 削除/引用 No.3297-7 - 2010/10/06 (水) 03:01:47 - おお >プラスミドの量は50ngと多めに流しました。 ひとやマウスで考えても1000倍多いです。 なので、ゲノムから検出できるかどうかのコントロールにはなってません。 プローブの取り込み効率が妥当であるか確認してないようであれば確認した方がいいと思います。これが感度に大きく影響されます。 制限酵素はCpGメチレーションには影響されないのでおそらく大丈夫だと思います。 切れ具合は複数サンプルがあってどれもえいどうパターンが酷似しているようであれば大丈夫かもしれません。 一つの酵素だけではサイズ的に苦しいでしょうか?

(無題) 削除/引用 No.3297-6 - 2010/10/05 (火) 17:04:43 - 中年 ポジコンのプラスミドのサイズが分からないので仮に6kbとすると、ウシのゲノムサイズは3,000Mbということですので、ポジコン50ngにはゲノム10ugの2,500倍のコピー数の標的があることになります。ポジコンのバンドがまともに検出できる条件でサザンのバンドが見えないのは当然ではないでしょうか。

(無題) 削除/引用 No.3297-5 - 2010/10/05 (火) 16:33:51 - トピぬし おおさん、Actiasさん ありがとうございます。 使用した制限酵素はHindIIIとPvuIIのダブルです。 予想バンド位置は約2.5kbです。 プラスミドの量は50ngと多めに流しました。 プラスミドで検出できたバンドはきちんとその位置に見えます。 また，制限処理後のゲノムはスメア状になっていました。 はっきりとしたサテライトバンドのようなものは確認できませんでした。 ちなみに制限酵素処理は50マイクロリットルの系で，合計4.5マイクロリットルの制限酵素を使用しており，37度×16時間です。

(無題) 削除/引用 No.3297-4 - 2010/10/05 (火) 08:25:31 - Actias おおさんに補足。 ウシゲノムサイズ ハイブリしたい領域のサイズ 泳動するDNA量 以上から、「泳動したゲノムDNAと同コピー数のプラスミド量」 を計算できます。 「うまく検出できない」 を詳細に説明してください。 ぼんやりとしたスメア状のしぐなるなのか、何も無いのか。 また、制限酵素処理したゲノムDNAを泳動して、どのように見えましたか？ 制限酵素の種類によると思いますが（なので、おおさんの質問が出たと思いますが)、酵素処理後の泳動で、スメアな泳動像だけでなく、バンドが見えることがあります。 それが見えることが、ゲノムが切れていることの証し、というひとも居ます。 切れるべきところが全部切れたゲノムDNAでないと、バンドは期待できません。

(無題) 削除/引用 No.3297-3 - 2010/10/05 (火) 04:39:34 - おお 制限酵素はなに使ったんでしょうか。

(無題) 削除/引用 No.3297-2 - 2010/10/05 (火) 02:05:10 - おお ポジこんのプラスミドの量はだとうですか。 たとえばげのむにそのポジこんを10ー30pg加えて、制限酵素処理してながすと。ぽじこんが期待した位置にきますか?

ウシゲノムのサザンブロットについて 削除/引用 No.3297-1 - 2010/10/04 (月) 18:05:48 - ウシサザン お世話になっております。 私はウシのとある遺伝子を調べています。 今回ゲノムDNAを用いてサザンブロットを行おうと考えており，実際にやってみたところうまく検出できませんでした。 シングルコピーの遺伝子です。 流したDNAは10マイクログラムで，制限酵素処理後のエタ沈なしで電気泳動しました。 プローブはDIGラベルしたPCR産物で，インストラクション通りの濃度です。 ポジコンのプラスミドDNAははっきりと検出できました。 どこかしらに改善点があるのでしょうが，はっきりわかりません。 どなたかお詳しい方，アドバイスよろしくお願いします。

全13件 ( 1 〜 13 )　 前 | 次 　1/ 1. /1

パスワードを入力してチェックした記事を

チェックした記事を

---