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酵素 抗体標識 トピック削除
No.3292-TOPIC - 2010/10/02 (土) 19:34:30 - 酵素標識
今、抗体に酵素を標識しようとしています
この際、未反応の酵素、抗体を除去しようと思うのですが
透析ではうまく分離できそうにありません(分画分子量の関係で)
また、透析で体積が不明になると、プロトコールどおりの濃度でできません。かといって凍結乾燥できるほど十分量ありません(酵素の量は50マイクログラムていど)

皆さんは微量の酵素(抗体)に抗体(酵素、色素)を結合させた後、精製等どのようにされているでしょうか?

教えていただければ幸いです
よろしくお願いします
 
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御礼 解決済み 削除/引用
No.3292-5 - 2010/10/03 (日) 16:22:00 - 酵素標識
皆様
貴重なご意見ありがとうございました

(無題) 削除/引用
No.3292-4 - 2010/10/02 (土) 22:09:51 - AP
私ならゲル濾過を検討します。
Sephadex G-75やSephacryl S-100あたりなら抗体あるいは抗体-酵素は、DNA exclusion limitを超えるので、最初のvoid volumeで回収でき、一方、酵素単体は分画範囲内にあるので、カラム内に残ると思います。微量なのでミニカラムの自然落下でできそうだし、それならそれほど希釈されないですむと思います。ただし、グルタルアルデヒドなどでカップリングすると、酵素同士の重合体ができてexclusion limitを超えてしまうかもしれません。

あとは、そういう例を聞いたことないですが、Protein-A/Gなどで抗体をアフィニティー精製してフリーの酵素を除くとか。

御礼 削除/引用
No.3292-3 - 2010/10/02 (土) 21:42:34 - 酵素標識
早速のご返答ありがとうございます

実は、あまりメジャーでない酵素を抗体に固定化しようとしています
抗体をIgGと同等と仮定すると分子量15万程度 酵素は分子量5万程度
です
どちらも内容量は50μg程度と微量です。組織への非特異的吸着を抑制するには未反応のものを除去したほうがいいのかと思い、精製方法および回収方法に悩んでいます。
透析その後の凍結乾燥が一番なのでしょうが・・・・
何かいい手法はありますでしょうか?

(無題) 削除/引用
No.3292-2 - 2010/10/02 (土) 21:05:35 - ami
http://www.cosmobio.co.jp/product/koutai_assei/cat436/01440001_4.asp?entry_id=3116

愛用。

酵素 抗体標識 削除/引用
No.3292-1 - 2010/10/02 (土) 19:34:30 - 酵素標識
今、抗体に酵素を標識しようとしています
この際、未反応の酵素、抗体を除去しようと思うのですが
透析ではうまく分離できそうにありません(分画分子量の関係で)
また、透析で体積が不明になると、プロトコールどおりの濃度でできません。かといって凍結乾燥できるほど十分量ありません(酵素の量は50マイクログラムていど)

皆さんは微量の酵素(抗体)に抗体(酵素、色素)を結合させた後、精製等どのようにされているでしょうか?

教えていただければ幸いです
よろしくお願いします

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