全7件 ( 1 〜 7 )　 前 | 次 　1/ 1. /1

(無題) 削除/引用 No.3286-7 - 2010/10/08 (金) 05:39:00 - おお 初期のひとくいの増幅をおさえるなら、タッチダウンという手もあるよ。

参考になるかどうかはわかりませんが 削除/引用 No.3286-6 - 2010/10/04 (月) 14:16:14 - bluehornet 私は日常的にある論文記載のマルチプレックスPCRを行っています。開始当初は論文記載の通りにAmpliTaq Goldを用いて行っていましたが、増幅効率に多少の不満があったので酵素の変更を検討しました。 そのときに検討を行ったのは、増幅効率の高さを謳ったTaKaRaのMightyAmp、TOYOBOのKOD plus ver.2、KOD FXの三種類でしたが、PCR産物のピークパターン（キャピラリー電気泳動でGeneScanをやってます）に各酵素間で違いがあったので、AmpliTaq Goldのピークパターンを最もよく再現したKOD FXに変更することにしました。増幅効率はいずれも高く、少なくともAmpliTaq Goldの数十倍はある感じでしたよ。 taqさんの場合は全く増幅しないということですが、PCRのサイクル条件を検討されてはどうでしょうか？TaKaRaのEx Taqも高増幅率を謳っていますから、マルチプレックスとはいえ全く増幅しないということは考えにくいと思います。 あとは、個々のシングルPCRがうまくいくかどうか検討する方法もあると思いますがどうでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.3286-5 - 2010/10/02 (土) 18:44:51 - real-time プライマーダイマーがでてればホットスタートの有無、活性時間の違いでしょうが、全くバンドが出ないのであれば、MgCl2濃度の違いかもしれません。QiagenでTaq Goldに似たpolymeraseを見たことがありますが、今はあるか分かりません。

(無題) 削除/引用 No.3286-4 - 2010/10/02 (土) 09:27:23 - taq ＞APさま 違いについてよく分かりました。参考にさせていただきます。 もしご存知でしたらampli taq goldに類似した特徴をもつその他の酵素を知っていたら教えていただけると助かります。 ＞amiサン 質問の説明不足かもしれませんが、当然のことながらそういった可能性は想定しています。

(無題) 削除/引用 No.3286-3 - 2010/10/01 (金) 22:37:13 - AP AmpliTaq GoldはTime Release は、PCRと称して、加熱時間が長くなるにしたがって、徐々に酵素の活性化が起こるような修飾がされているのがもっとも大きく違うところでしょう。PCRの初期では鋳型DNAが少なく、過剰な酵素活性が非特異的産物を生じやすいので、酵素活性は低く抑えたほうがよい、PCRが進むにしたがって鋳型が増えてくるので、それに応じて酵素活性が高くなっていったほうが増幅効率がよい、という理屈です。これで最適化した条件は、ほかの酵素ではうまくいかなくて当然です（というか、ほかの酵素でうまくいかなかったのが、この酵素では成功するということも少なくない）。

Taqの違いかもしれないし 削除/引用 No.3286-2 - 2010/10/01 (金) 22:07:43 - ami Templateの質の違いかもしれないし、Primerの精製度の違いかもしれないし、試薬ミキシングの問題かもしれないし、サーマルサイクラーの違いかもしれない。

taqの使い分けについて 削除/引用 No.3286-1 - 2010/10/01 (金) 18:35:13 - taq 論文に記載されている方法（ampli taq goldをtakara ex taqに変更）でマルチプレックスＰＣＲを行いましたが、増幅しませんでした。 テンプレートの確認などは行っているので試薬の違いによるのが原因と考えています。 ampli taq goldとtakara ex taqでは特徴としてマルチプレックスに向き不向きがあるものでしょうか？ takaraからはマルチプレックス用のキット等も出ているようですがここら辺の使い分けをしているかたがいましたら助言いただけると助かります。

全7件 ( 1 〜 7 )　 前 | 次 　1/ 1. /1

パスワードを入力してチェックした記事を

チェックした記事を

---