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追加 削除/引用 No.3278-7 - 2010/10/01 (金) 18:16:23 - 匿名 一つ疑問に思う点がありましたので、追加します。 PromegaのTnT Coupled Reticulocyte Lysate Systemは可溶性のタンパク質の翻訳に向いていますが、膜タンパク質や分泌タンパク質の翻訳には向いていなかったように思います。 アミラーゼは分泌タンパクではないかと思ったのですが、可溶性タンパクとして扱って大丈夫なものでしょうか？ シグナルペプチドが付いていて膜を横切るタイプのタンパク質については、イヌの膵臓由来の小胞体画分を添加した実験系でin vitro translationが可能であると聞いたことがあります。 残念ながら私にはその経験がありませんが、その方法は収率もよくないと聴いたことがありますので、あまりお薦めではありません。

(無題) 削除/引用 No.3278-6 - 2010/10/01 (金) 18:03:35 - 匿名 PromegaのTnT Coupled Reticulocyte Lysate Systemで様々な遺伝子をin vitro transcription translationしたことがありますが、ラベルの取り込み率は10%以下であることが多かったです。 ですので、取り込み率が60%と聞いて、そちらのほうに驚きました。 60%の取り込み率には疑問がありますが、それはさておき、私の知っていることをお伝えします。 ラベルの取り込み率はもちろんメチオニンの数に影響されますが、総じて短いタンパク質のほうが取り込み率が高い傾向がありました。 SDS-PAGEした後にオートラすると翻訳物のパターンが見えますが、サイズの大きいタンパク質では低分子側にスメアなバンドが見えることがあり、転写・翻訳の過程で不完全な産物ができて反応が止まっているか、あるいは生成物が分解している可能性がありました。 ですので、もし必要な領域が判っているのでしたら、タンパク全長ではなく一部のドメインなどに着目して翻訳物のサイズを小さくする工夫をされると有効かもしれません。 あと、Promegaのこのキットはplasmidを直鎖化する必要がありません。 もし直鎖化されていた場合は制限酵素をcheckしてみてください。 ご存知だと思いますがオーバーハングの形によってRNAの転写効率が大きく変わります。 また今回はpTnTベクターをご使用とのことなので蛇足になりますが、翻訳物の量はベクターにも依存します。 最後に気になったのが、ラベルの取り込み率の測定方法です。 TCA沈殿を再溶解して液シンで測定する場合、残存するTCAのせいで非特異的な発光が起こり、取り込み率を過大評価することがあります。 シンチレーターによって性能が異なりますので、この点についても確認を取られたほうがよいかもしれません。 また、電気泳動物をオートラで定量化する場合、ゲルを十分に乾かさないと水分による減衰で取り込み率を過小評価することがありますので、ここも注意点になるかと思います。

ご回答有り難うございます。 削除/引用 No.3278-5 - 2010/09/30 (木) 20:08:14 - sayaka ＞Actiasさま。 ご回答有り難うございました。ご指摘いただいた事、検討致しましたが、異常なしでした。 RNAが壊れているか、私も気になっているのですが、キットでシステム化されているので、このプロトコルで行うと確認できないです。 ＞おおさま。 ＞この７％は何の数字、総量のラジオアクティブな活性と取り込まれた蛋白の放射化性から求めてるのでしょうか。。。 その通りです。 今ラボの別のチームが行っているタンパクでは高くて60％くらいのincorporationが認められるので、７％はすくないですね。メチオニン量も多い方タンパクなので、せめて２０％のincorporationが欲しいところです。 ＞そもそも得られた蛋白は全長でしっかりと検出できているのでしょうか、、、 SDS-PAGEとかで、ということでしょうか。まだ確認はしていません。ラボのプロトコルが確立されているので、全員が数字だけみて判断しているところです。必要なので直談判してみます。 ＞ 中年さま。 ＞「ラベルされるパーセンテージ」ってどういう意味で言ってます？ 総量のラジオアクティブな活性と取り込まれた蛋白の放射化性から、Sメチオニンでラベルされたタンパク質のパーセンテージとしています。

(無題) 削除/引用 No.3278-4 - 2010/09/30 (木) 10:43:26 - 中年 「ラベルされるパーセンテージ」ってどういう意味で言ってます？

(無題) 削除/引用 No.3278-3 - 2010/09/30 (木) 04:36:54 - おお どこが悪いのかはアウトプットしか見てないのでわからないっすね。 この７％は何の数字、総量のラジオアクティブな活性と取り込まれた蛋白の放射化性から求めてるのでしょうか。。。少ないのかそれでも何とかなるのかはわかりませんが、もしかしたらそんなもんかもしれないとも思ったりします。 そもそも得られた蛋白は全長でしっかりと検出できているのでしょうか、、、 RNAを転写して精製してからRNAをくわえて蛋白合成した方が効率がいいと一般的にはいわれてます。

(無題) 削除/引用 No.3278-2 - 2010/09/29 (水) 23:21:22 - Actias pDNAR-LIB からpTnT vector に載せ換えたわけですね。 TnT Coupled Reticulocyte Lysate System がT7かT3かSP6か知りませんが、pTnT vector からの転写の向きと遺伝子の向きは合っていますか？ 5'-β-globin leader sequenceに何が入っているか知りませんが、転写産物が翻訳されるためのCACC-ATG とかになっていますか？フレームは合っていますか？翻訳途中にストップコドンは入ってないですか？ 確かめ方が分かりませんが、転写されていますか？RNA が壊れてないですか？

in vitro transcription translation and Methionine labeling 削除/引用 No.3278-1 - 2010/09/29 (水) 22:24:20 - sayaka ヒトアミラーゼcDNA（pDNAR-LIB vector）をpTnT vector(Promega)にサブクローニング(KpnI と XbaI)して、in vitro transcription translationを試みています。その際に、35S-Methionineでラベリングも同時にしていますが、うまくラベルされません。使用しているキットはPromegaのTnT Coupled Reticulocyte Lysate Systemです。反応時間は９０分。 今のところラベルされるパーセンテージが７％と低いのですが、原因が分かりません。 最低でも２０％必要は必要です。パーセンテージを上げるために、考えられる事をお教えいただければと思います。 宜しくお願い致します。

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