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(無題) 削除/引用 No.3269-7 - 2010/09/28 (火) 17:14:34 - 月光 　おおさん、g-ajさん、弘法さん、ぶんさん、アドバイスどうもありがとうございます。とりあえずZymolyase法とNaOH法を試してみようと思います。

(無題) 削除/引用 No.3269-6 - 2010/09/28 (火) 12:56:03 - ぶん Zymolyase(6mg/mlを10xとして　1/3x)40ulにコロニーを少量懸濁して 37℃で30分→vortex・遠心して上清1ulを20ulの系でPCRにかけます。 量が多い時はZymolyase処理から8連を使えばPCRの機械で出来るので楽です。 （遠心はプチ8で） ゲノムを抽出するよりは汚いですが、2kbpぐらいまでならかかります。 ゲノム抽出の簡単法は Zymolyase　3X　40ulにコロニーを少量懸濁して37℃で30分→70℃10分（70℃はしなくてもOK） 遠心して水で洗って、TE-10ul 10%SDS-1ul NaCl-1ul ProKに懸濁して55℃30分 →TE50ul加えてフェノクロ→クロロフォルム→上清をとってPCR コロニーPCRよりは面倒ですがやっぱり綺麗です。

(無題) 削除/引用 No.3269-4 - 2010/09/28 (火) 12:02:48 - 弘法 Zymolyaseを掛けることは有効です。NaOHを使う次のような方法もあります。 http://openwetware.org/wiki/Blackburn:Yeast_Colony_PCR http://openwetware.org/wiki/Blackburn:Yeast_Colony_PCR_v2.0 いずれの場合も菌体量を多くし過ぎないことがコツかと思います。

(無題) 削除/引用 No.3269-3 - 2010/09/28 (火) 11:32:03 - g-aj クルードサンプルの増幅に強いと宣伝されているPCR酵素が何種類か発売されていますので、これらを使われてはどうですか？ 下のURLはKOD FXの酵母のコロニーPCRの実施例です。 http://www.toyobo.co.jp/seihin/xr/lifescience/products/product/jisshirei/archives/2008/07/kod_fx89.html

(無題) 削除/引用 No.3269-2 - 2010/09/28 (火) 10:48:00 - おお そのまま、コロニーをつっついてPCRしても、酵素で細胞壁を壊しても理論的にはかかります。クルードなので、若干条件が難しくなっているのだと思います。プロダクトの長さをなるべく短くして、効率のいいプライマーを 設計すればかかるはずだと思います。

酵母のゲノムDNAに対するPCRについて 削除/引用 No.3269-1 - 2010/09/28 (火) 10:30:44 - 月光 　酵母のゲノムDNA挿入型のベクターに乗せた遺伝子が、ゲノムDNAにきちんと入っているかを調べるため、これまで酵母ゲノムDNAをテンプレートとしたPCRを行ってきたのですが、複数種類の酵母をスクリーニングする場合など多数のクローンからゲノムDNAを抽出・精製するのは大変です。そこでコロニーPCRを行ったのですが、全く増幅が見られませんでした（精製されたゲノムDNAをテンプレートにした場合は増幅するので、ゲノムDNAの抽出がうまくいっていないと思われます）。 　そこで質問なのですが、酵母のゲノムDNAを精製することなくゲノムDNAをテンプレートとしたPCRを行う方法をご存知でしょうか。 　自分で調べたところ、酵母のコロニーをZymolyaseに懸濁し、しばらく保温した後、この懸濁液をテンプレートとする方法があるようですが、こういった方法はゲノムDNAをテンプレートとしたPCRに有効なのでしょうか？

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