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ありがとうございます 削除/引用 No.3265-10 - 2010/09/29 (水) 21:39:57 - 軟太郎 自己流で回収したRNAは、real-time PCRでACTB, GAPDHのかかりが 非常に悪く、評価に耐えうる結果をだすことができませんでした。 シリカさんご紹介の文献を参考にQIAGEN社キットのRLT bufferと RNA抽出カラムを用いてトライしてみたところ、収量はだいぶ 減少しましたが、純度は改善したようです。 このサンプルでPCRがかかるか試し、報告したいところですが、 ボスとも相談し、他の手がけていることを優先し、 本案件は一旦保留することになりました。 おおさん、Bostonさん、amiさん、masaさん、シリカさん、 アドバイスを頂き大変勉強になりました。ありがとうございました。

(無題) 削除/引用 No.3265-9 - 2010/09/29 (水) 07:17:17 - シリカ どのくらいきれいにとれるかわかりませんが。 http://www.nature.com/nprot/journal/v4/n6/full/nprot.2009.63.html http://www.sciencedirect.com/science?_ob=ArticleURL&_udi=B6W9V-4J32H2W-1&_user=950412&_coverDate=04%2F15%2F2006&_rdoc=1&_fmt=high&_orig=search&_origin=search&_sort=d&_docanchor=&view=c&_acct=C000049140&_version=1&_urlVersion=0&_userid=950412&md5=a7c4fb957b5d958b3889eef6e2eb29a8&searchtype=a

(無題) 削除/引用 No.3265-8 - 2010/09/29 (水) 04:53:49 - おお >ゲルからのDNA切り出し用のキット（QIAGEN）のアガロースを >溶解させる試薬に、培養ゲルを浸して、溶解後、 >ISOGEN試薬により、イソプロ沈で抽出はしてみました。 >ペレットとしては大きすぎる？のではないかと思うくらい >沈殿しましたが、Nuclease-free waterに不溶なものが多く、 >多糖類が共沈していると考えてよろしいのでしょうか。 細かいことは書きませんが、アガロースが混入していると思います。アガロースの溶解はグアニジンやヨウ素イオン、ウレアなどで溶解できますが、糖類はアルコールに不溶なので核酸と一緒に沈殿してきてしまいます。得られたRNAがインタクトなら、リチュウムクロライドを使った沈殿で回収するか、Cetyltrimethylammonium bromide (CTAB) を使って沈殿させて 回収する手もあります。アガラーゼも有効なきがします。 リチュウムクロライドは100b付近から短いものは回収率が悪くなります。目的のRNAのサイズを考慮して使えるかどうか判断してくださいCTABは詳細はわかりません。 肝臓からRNAをとるときも同じようなトラブるがあることがあります。 最近では、キットなどに対処法をかいたものもあったと思います。ここでも議論にたまに上がっています。 コロニーをつっついて拾ったときの収量ですが。細胞の数がわかればだいたい検討がつくと思います。 逆に全部回収して精製を一度やっていらっしゃるのですから、 その時全体で何個くらいのコロニーがあってと計算していくと収量はラフに見積もれますよね。 ただコロニーをあまり大きくしすぎると真ん中はし細胞があるともききますので、ちょっと悩ましいいところですよね。

(無題) 削除/引用 No.3265-7 - 2010/09/28 (火) 14:36:40 - 軟太郎 みなさま色々とsuggestionありがとうございます。 助言を頂く前に、自分で手法としての妥当性はともかくとして、 以下の通りにやってみました。 すなわち、 ゲルからのDNA切り出し用のキット（QIAGEN）のアガロースを 溶解させる試薬に、培養ゲルを浸して、溶解後、 ISOGEN試薬により、イソプロ沈で抽出はしてみました。 ペレットとしては大きすぎる？のではないかと思うくらい 沈殿しましたが、Nuclease-free waterに不溶なものが多く、 多糖類が共沈していると考えてよろしいのでしょうか。 吸光度から推測する純度も低いものでした。 培養条件は変更したくないものですから、 ゲルの組成変更などは今回は回避したいと思っております。 頂いたアドバイスは今後機会があれば検討したいと思います。 コロニーをピックアップすることは経験がなく、 （以前別トピックで話題を読んだことはありますが） 少し自信がなかったものですから、安直に、 ポリクローナルに処理する方法を模索しておりました。 コロニー10個くらいあれば、RNAの収量としては 保たれるということでしょうか。 私は通常、RNA 1ugをcDNAにしておりますが、 濃度としても RNA 0.2 ug/uLくらいは担保できると嬉しいのですが。 もちろん、細胞の種類、培養条件の結果できる コロニー形成細胞数によるでしょうから、答えられる質問では ないかもしれませんが、おおよそどのくらいRNAが得られるのか ご存知でしたらご教授お願いいたします。

(無題) 削除/引用 No.3265-6 - 2010/09/28 (火) 10:38:19 - masa 軟寒天培地培養法で培地中に細胞を巻き込む方法ではなく、寒天培地の上に細胞を只撒くだけの方法では駄目でしょうか？ そちらでも巻き込むのと同じ傾向が見れる印象があります。細胞が転がって付着しあってしまい、単一のコロニーを形成しにくい等の欠点はありますが。。。 あとメーカーは忘れてしまったのですが、MTT試薬で足場依存性を評価するkitで、細胞を寒天培地で培養後に特殊な試薬で寒天を融解させ、測定するというものがあったと思います。そのkitを応用すれば細胞を回収できるかもしれません。寒天も特殊な仕様っぽいので試薬だけ買えばいいという物ではなさそうでした。

(無題) 削除/引用 No.3265-5 - 2010/09/28 (火) 10:04:57 - おお メチルセルロースとかカルボキシメチルセルローズだとどうかなぁ。。。。薄めて遠心で回収できるかもしれない とおもったが本当はよくわからない。 アガラーゼなんかも可能性としてはあると思うけど、、 http://www.nebj.jp/products/detail/303 あとはフィコールで密度勾配遠心とかも考えられると思いますが、、わかりませんじっさいのところ。 あとは植物用のRNA抽出キットは多糖を除去できるので使えるかもしれません。

(無題) 削除/引用 No.3265-4 - 2010/09/28 (火) 09:51:51 - ami low-melting temperature agaroseとかだめなのかなぁ、、、おもいつきですが。

(無題) 削除/引用 No.3265-3 - 2010/09/28 (火) 09:00:09 - Boston おおさんと同意見です。 また、せっかくコロニー形成させているので、コロニー個々について遺伝子解析するのも良いのではないかと感じます。 どうしても全体とこだわるのであれば、ソフトアガーでなく、撹拌培養となるのではないでしょうか。足場非依存的に増殖する細胞のはずなので。ハンギングドロップ法なども使えそうな気がしますー経験に基づくものではないです。

(無題) 削除/引用 No.3265-2 - 2010/09/28 (火) 06:59:23 - おお 何個かピックアップして細胞を回収すればいいのでは、全体でみたいにしても10個とかピックアップすれば、全体を反映しているようにも思うのですが、そういう実験ではないのですか、、、 それともあまり増えないとか、薬剤の影響でどの程度コロニーが抑制されているかみたいな実験の延長でやってるんでしょうか。

軟寒天培地中の細胞からのRNA抽出法 削除/引用 No.3265-1 - 2010/09/26 (日) 18:50:58 - 軟太郎 軟寒天中でコロニー形成した細胞からRNAを抽出する方法があれば教えてください。 足場非依存性増殖能を評価するため、軟寒天培地で培養し、コロニーを形成できた細胞における遺伝子発現をRNAレベルで評価するためその方法を探していますがわかりませんでした。 3.5cm dishで top agar(1.5mL); 0.35% agarose, DMEM with 10% FBS base agar(1.5mL); 0.5% agarose, DMEM 上記組成で培養しております。 細胞は、ヒト癌細胞株（自分で樹立したようなものではなく、 いわゆるコマーシャルに入手可能なありふれたもの）を用いており 1個1個のコロニーを単離したいわけではなく、 寒天培地中に存在する細胞全体からのRNA抽出です。 よろしくお願い致します。

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