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(無題) 削除/引用 No.326-7 - 2009/04/16 (木) 14:05:50 - EMSA おおさん、ありがとうございました。 やはり、このままでは難しそうなので、よく検討してみようと思います。 参考になりました。ありがとうございました。

(無題) 削除/引用 No.326-6 - 2009/04/15 (水) 20:32:44 - おお >どこに結合しているかについてOne-hybridで使った配列を含む場所と違う場所に結合したことに問題はないかと思っています。 one-hybridで使った場所に直接つかないないが、そのほかの場所について、その下流の 遺伝子を制御しているならone-hybridのデーターはその意義について分からない ということになる可能性があります。ですから、one-hybridのデーターを使うのは むりがあります。それでもそのTFがその遺伝子を制御しているといえるなら、 one-hybridのデーターなしでまとめるほうがいいかとおもいます。 one-hybridで使った領域について何かのデーターを得たいというのであれば そのTFについてはその状況では役に立ちません。 一つ可能性があるとすればそのTFはちがうTF(TF2としましょう)と相互作用し TF2がone-hybridで使った場所に結合するという図式が考えられます。 TF2は単独で転写活性化能が弱いか、あるいはないかもしれません。 このばあいおそらく酵母に保存された転写制御因子が実際にアラビドプシスで 生理的には作用しているだろうと思えます。

(無題) 削除/引用 No.326-5 - 2009/04/15 (水) 16:50:17 - EMSA おおさん、理解力不足ですいません。回答ありがとうございます。 >[Re:4] おおさんは書きました : > ネガコンにその興味ある配列が挿入されていないレポーターを使ったかどうか聞きたかったわけです。ベクターバックボーンやレポーター遺伝子自身 にTF結合サイトがあれば、動いてしまいますから。 これについては、yeastのみと、yeast＋ベクターに何も挿入されていないものを使っているので、問題ないはずです。 > 植物に詳しくないですし、プロモーターとおっしゃっているのが基本転写因子結合場所をいっているのか、プロモーターを活性化するエンハンサーの話をしているのかいまいちよく分かりませんが、エンハンサーであれば転写開始いちから多少離れた場所にあってもいいと思いますほ乳類では10kb上流とか下流のその遺伝子のイントロンやエクソンにエンハンサーがあることがあります。 これについては、ORFから1800bp上流領域までにプロモーター領域があるであろうと推定してやってました。そこまでの領域がプロモーター領域かどうかは調べていません。 > 期待した位置と違ったということですが、それがどのように予測されたのかなどよく分かりませんので、細かいことはいえませんが、重要なことはそのTFが実際に下流の遺伝子を制御しているかとそれがどこに結合しているかということでは無いでしょうか。 期待した位置というのはOne-hybridで使用した配列を含む断片に結合しなかったということです。 たしかに、そのTFが下流の遺伝子を制御しているかどうかは重要な問題だと思っています。それについては今後やっていこうと思っています。どこに結合しているかについてOne-hybridで使った配列を含む場所と違う場所に結合したことに問題はないかと思っています。

(無題) 削除/引用 No.326-4 - 2009/04/15 (水) 16:06:48 - おお >[Re:3] EMSAさんは書きました : > おおさん、早速の回答ありがとうございます。 > 調べている対象がアラビドプシスなので、One-hybridでとれた配列から、完全長のcDNAを取り寄せ、One-hybridの再確認は行っております。 ネガコンにその興味ある配列が挿入されていないレポーターを使ったかどうか 聞きたかったわけです。ベクターバックボーンやレポーター遺伝子自身 にTF結合サイトがあれば、動いてしまいますから。 > 指導教官と今考えているのは、One-hybridでは配列がタンデムリピートになっているので、ゲルシフトと条件が変わっているのではないか？ということです。 可能性はあるとおもいます。 >このTF候補で論文を書く場合、プロモーター配列の別の場所に結合したことで何か問題があるでしょうか？それともプロモーター配列に結合したことで、対象の遺伝子のTFだと言っていいものなのでしょうか？ 植物に詳しくないですし、プロモーターとおっしゃっているのが基本転写因子結合場所を いっているのか、プロモーターを活性化するエンハンサーの話をしているのか いまいちよく分かりませんが、エンハンサーであれば転写開始いちから多少離れた 場所にあってもいいと思いますほ乳類では10kb上流とか下流のその遺伝子の イントロンやエクソンにエンハンサーがあることがあります。 期待した位置と違ったということですが、それがどのように予測されたのかなど よく分かりませんので、細かいことはいえませんが、 重要なことはそのTFが実際に下流の遺伝子を制御しているかと それがどこに結合しているかということでは無いでしょうか。 因みに結合したというだけでは、そのTFがその遺伝子を制御している というには弱すぎると思います。

(無題) 削除/引用 No.326-3 - 2009/04/15 (水) 12:13:46 - EMSA おおさん、早速の回答ありがとうございます。 調べている対象がアラビドプシスなので、One-hybridでとれた配列から、完全長のcDNAを取り寄せ、One-hybridの再確認は行っております。指導教官と今考えているのは、One-hybridでは配列がタンデムリピートになっているので、ゲルシフトと条件が変わっているのではないか？ということです。このTF候補で論文を書く場合、プロモーター配列の別の場所に結合したことで何か問題があるでしょうか？それともプロモーター配列に結合したことで、対象の遺伝子のTFだと言っていいものなのでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.326-2 - 2009/04/15 (水) 11:39:12 - おお スクリーニングのあとのチェックとして イーストで何らかの確認をしているでしょうか? その時のネガコンが適切でないならそういうことは あるかもしれません。 あとはそのTFのコンセンサスは含まれているものの、 周りの配列の環境などが違うことによって、目的の 生物では結合しない可能せいとかもあるかもしれません。 偶然とはいえ、考えている遺伝子を制御しうるTFがとれた可能制は ありますね。

ゲルシフトの結合領域 削除/引用 No.326-1 - 2009/04/15 (水) 10:29:10 - EMSA いつもお世話になっております。 One-hybrid法で見つけてきたTF候補遺伝子からタンパクを作成して、ゲルシフトをしました。当然、One-hybridで使用した配列に結合すると思っていたのですが、プロモーターの違う領域に結合してしまいました。こういう事ってあるものなんでしょうか？よろしくお願いします。

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