全7件 ( 1 〜 7 )　 前 | 次 　1/ 1. /1

(無題) 削除/引用 No.3255-8 - 2010/09/23 (木) 21:29:33 - nori うーん様、み様、ATCG様 早速のご回答有り難うございます。 trasfectionの条件検討からposi. con.をとって再度検討します。

(無題) 削除/引用 No.3255-7 - 2010/09/23 (木) 19:18:50 - ATCG この手の実験では各段階でいけてる事を確認しながらやらないと、時間がもったいないからね。まずは遺伝子導入と蛋白質の発現がちゃんといけてるかどうかをまず押さえないといけないね。みんな死んじゃうのはたぶんそれがうまくいってないような気がするけどどうかな。確認はwesternでもいいけど、導入された細胞が少ないとうまく見れないかもしれないから免疫染色もした方がいいと思う。Fugene６はいろんな細胞に結構いいと思うけど、もし駄目っぽいなら、試薬と細胞の相性みたいのがあるから（この組み合わせは大事らしい）、過去の文献とかネット情報とかで、L細胞に実績のあるtransfection試薬を探す事も必要だね。Fiugene今イチのとき古典的リン酸カルシウム法でうまくいったことあるよ。 取りあえず遺伝子入ってそれなりに発現してる細胞があることが確認されたら、stable 取りにgoかな。ここまでいければあとはもうそんなに大変じゃないから。発現量のこのもあるから、あるていどの数クローンを取った方がいいよ。

(無題) 削除/引用 No.3255-6 - 2010/09/23 (木) 18:56:55 - み L細胞なら普通に安定発現細胞樹立できますよ。 そもそも「うーんさん」が指摘されたように３．のtransientで発現が確認できていない時点で問題ありでしょ。 sequenceしたからって何ですか？まともに翻訳されるように設計されているかも疑わしい。 transfectが上手くいっているかも不明って。 薬剤添加の時期も問題ないのでしょうか？ 問題点が山積ですね。

(無題) 削除/引用 No.3255-5 - 2010/09/23 (木) 18:03:35 - うーん >1. G418 300 ug/mlでselectionした場合、生き残った細胞はほとんど全て目的タンパクを発現しているものでしょうか？ >私は今500 ug/mlでselectionして、１週間でコントロールL細胞が全滅する状態です。 私は膜タンパク質のcDNAをpc.DNA3.1に組み込みlipofectionしました。 selection後、コロニーをpick upすることはせず、トリプシンで一気に剥がし、それをFACSで膜タンパクの発現を見たところ7-8割がpositiveでした。私はそのpositiveを更にcell sortingしました。 control vectorでの実験を行っていないとすると、おそらくその500 ug/mlって濃度もテキトーに決めたのでは？本当に500 ug/mlでないといけないの？G418めっちゃ高価ですよ？うちは段階的にG418濃度を希釈していき、ギリギリ細胞が死ぬ濃度（それが300）を決めてからtransfectionしました。500は高いなあという印象。 >2. お使いのvectorは pIRESですか？以前使っていたpcDNA3.1 vectorでは、生き残った細胞が取れたのですが50クローン拾ってタンパク発現している cloneがゼロでした。なので、pIRESにきりかえました。 vectorの問題よりもまずはあなたの実験でposicon, negaconを置く事。 ちゃんとボスかまともな人材に聞きながらやった方が早いですよ。 2. 細胞の継代回数はtransfectionにはクリティカルなものでしょうか？ それはあるかもしれません。それからtransfection時の細胞密度も大事。結構薄くまくと導入効率上がります。 >>ちなみに、fugene6でちゃんとcontrol vector（GFPなど可視化できるもの）は問題なく導入されることは確認してますか？ >確認していませんでした。transfection条件が問題である可能性はあると思います。 それはほんとありえないですね。

(無題) 削除/引用 No.3255-4 - 2010/09/23 (木) 17:30:42 - nori うーん様 アドバイス有り難うございます。 もう少しお聞きしたいことがあります。 1. G418 300 ug/mlでselectionした場合、生き残った細胞はほとんど全て目的タンパクを発現しているものでしょうか？ 私は今500 ug/mlでselectionして、１週間でコントロールL細胞が全滅する状態です。 2. お使いのvectorは pIRESですか？以前使っていたpcDNA3.1 vectorでは、生き残った細胞が取れたのですが50クローン拾ってタンパク発現している cloneがゼロでした。なので、pIRESにきりかえました。 2. 細胞の継代回数はtransfectionにはクリティカルなものでしょうか？ >ちなみに、fugene6でちゃんとcontrol vector（GFPなど可視化できるもの）は問題なく導入されることは確認してますか？ 確認していませんでした。transfection条件が問題である可能性はあると思います。

(無題) 削除/引用 No.3255-2 - 2010/09/23 (木) 16:53:53 - うーん 3の実験で問題があるようならstable取ろうなんて発想僕にはないです>< ちなみにうちのlabは教授がL cell 大好き人間なので、それ使って私も含めてstableを作製していますよ。G418 300 ug/mlで1-2週間もすればstableが取れます。 ちなみに、fugene6でちゃんとcontrol vector（GFPなど可視化できるもの）は問題なく導入されることは確認してますか？私しのlabではlipofectamine2000で問題なく入っています。最悪5割くらい。 ちなみに、retro viral infectionでもstableを取りましたが、感染効率3%ほどで非常に悪いです。 mouse retro virus receptorをtransientに発現させたところに、virusをinfectしても感染効率は変わらず。 あっ、L cellsは（stable作製には不向きだけど）DEAE-dextran methodで遺伝子導入できますよ。 lipofectionよりも高効率に。

stable cell lineの確立について 削除/引用 No.3255-1 - 2010/09/23 (木) 16:41:51 - nori 膜タンパク質を組み込んだpIRESneo3 plasmidをマウスL細胞へtransfectしstable lineを作製しようとしています。 現状はとしてはG418でselectionをかけているのですが、stable細胞が得られていません。 うまく行かない原因がわからず困っております。 そこで以下の点についてアドバイスを頂けたらお願い致します。 1. 培養細胞について 一般的にL細胞はstable lineを作製することが容易な細胞なのでしょうか？（L細胞でstable cell lineを確立している論文はあります。） 他にマウス接着系培養細胞でstable lineを作製することに適している細胞がありますか？ 2. pIRESneo3について このvectorを使った場合、細胞によって差はあるとは思いますがどのくらいの確率で生き残った細胞が出てくるのでしょうか？現在は、35mm dishのスケールでFugene6を用いてtransfectしています。コントロールのL細胞と同様にselection後１週間で全ての細胞が死んでしまいます。 3. transient expressionについて transfection後、２日、３日後の transient expressionを確認しましたが、目的タンパクの発現が全く見られません。insert配列はmutationが入っていないことを確認し、QIAprep miniで精製したplasmidを使っています。 他にアドバイスがありましたらよろしくお願い致します。

全7件 ( 1 〜 7 )　 前 | 次 　1/ 1. /1

パスワードを入力してチェックした記事を

チェックした記事を

---