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大腸菌に対する殺菌効果の実験について トピック削除
No.3232-TOPIC - 2010/09/19 (日) 00:50:38 -
こんにちは。はじめまして。

現在、大腸菌に対する塩基性抗菌性蛋白の殺菌効果について実験を行っています。

実験の手順としては、簡単に言うと

@菌液の吸光度を測定後、希釈(だいたい10000倍くらい)
A希釈した菌液を遠心分離器にかける
B上澄みをとり、洗浄する
C塩基性抗菌性蛋白と合わせて、1時間培養
Dシャーレに蒔いて、24時間培養

という流れです。

本来ですと、コントロールと比較して少なくはなりますが菌が生えるはずなのですが、何度行ってもまったく生えません。
希釈を100倍にしてみても生えませんでした。

実験には、BHI液体培地と血液寒天培地、PBSを使用しています。

また、希釈のみを行った時は生えたので、希釈はおそらくできていると思います。

コロニー数を数えて殺菌効果を比較する実験なので、菌が生えないと実験が成り立ちません。ですが、生えない原因が分からなくて・・・

何かアドバイスをいただけたら幸いです(>_<)
 
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(無題) 削除/引用
No.3232-3 - 2010/09/19 (日) 11:56:37 - 774
最初に思ったのは、遠心の後に再懸濁する時には菌塊は確認しているでしょうから、減りはしても無くなることはないのかなと。
であれば、遠心時のGが大きすぎるのではないかと。
そもそも遠心して回収する必要あるのでしょうか?

ODを測定した後に一定菌数に希釈したものに目的タンパク質を目的最終濃度になるように加え、1時間置いたのちそこから直接100μlなりをplatingするというのではだめなのでしょうか?
もしくはあらかじめ目的タンパク質を目的最終濃度になるように加えておいたものに希釈した菌液を加えて1時間培養するとか。


そもそも、質問自体が情報が少なすぎるし、主語等が曖昧で「何が???」という感じです。
例えば、

>希釈した菌液を遠心分離器にかける
→蛋白と合わせるステップにおける一本分づつ遠心したのか、まとめて行ったのか?

>コントロールと比較して少なくはなりますが菌が生えるはずなのですが、何度行ってもまったく生えません。
→コントロールは生えてるのか?生えないのはどのプレートなのか?

>希釈を100倍
→何の???

ある程度の予想はつくのですが、回答者が質問者の意図とは異なった解釈をしてしまった場合には両者の時間を無駄にしてしまいます。

(無題) 削除/引用
No.3232-2 - 2010/09/19 (日) 05:08:35 - おお
コントロールは生えてるんですか、、、
暫定的にIC50、はその濃度より低いと結論を下すことはできると思います。その抗菌性の蛋白の濃度を下げていけばいいと私はおもうのですが、

コントロールは生えているという前提で、、、

コントロールも生えないなら遠心で死んだか回収し損なったかだと思います。そもそもえんしんして回収する必要があるのでしょうか?

最終目的の菌体濃度の2-10倍の濃度に希釈して、その抗菌性物質をくわえて最終濃度を調整すれば遠心のステップは必要ないですよね。

希釈した状態で生えているわけですから、、、

大腸菌に対する殺菌効果の実験について 削除/引用
No.3232-1 - 2010/09/19 (日) 00:50:38 -
こんにちは。はじめまして。

現在、大腸菌に対する塩基性抗菌性蛋白の殺菌効果について実験を行っています。

実験の手順としては、簡単に言うと

@菌液の吸光度を測定後、希釈(だいたい10000倍くらい)
A希釈した菌液を遠心分離器にかける
B上澄みをとり、洗浄する
C塩基性抗菌性蛋白と合わせて、1時間培養
Dシャーレに蒔いて、24時間培養

という流れです。

本来ですと、コントロールと比較して少なくはなりますが菌が生えるはずなのですが、何度行ってもまったく生えません。
希釈を100倍にしてみても生えませんでした。

実験には、BHI液体培地と血液寒天培地、PBSを使用しています。

また、希釈のみを行った時は生えたので、希釈はおそらくできていると思います。

コロニー数を数えて殺菌効果を比較する実験なので、菌が生えないと実験が成り立ちません。ですが、生えない原因が分からなくて・・・

何かアドバイスをいただけたら幸いです(>_<)

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