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(無題) 削除/引用 No.3226-12 - 2010/09/21 (火) 02:26:21 - おお やってみないとわからない、あまりパブリッシュもされてない無責任な発言としてきいてください。 分解産物であるとしましょう(これはちゃんと検証したうえで)。 そうするとタグの位置からどちら側が削れているかわかります。削れている側の削れている位置を含む短い発現ベクターをつくります(この時oriが違ったものかdualの発現ベクターをつかう)。 で同時に全長も発現させる。短いもがプロテアーゼに対してデコイとなる可能性があるので発現比がいい具合であれば切れたものは減る可能性がある。 ま、かなり妄想にちかいですけど。 短いものが代わりにくっついて離れないかもしれませんけど。 ゲル濾過でサイズどのくらいに出ますか、シングルピークでしょうか?

(無題) 削除/引用 No.3226-11 - 2010/09/20 (月) 20:58:35 - おお 遠回しな発言ですが、シャペロニンあたりもうたがってました。なので本当に分解産物か検証がまず欲しいというのがありました。シャペロニンなら指摘がありますようにいくらか解決方法があります。 サイズ覚えてないんですけどね、、、 20kDaあたりだったかなぁ。 ホモダイマーとか、あるいは大腸菌の何かと結合しているときは外してやる必要がありますのでバッファーに界面活性剤を追加するか変えるなどの工夫が必要でしょう疎水クロマトをかますと、もしかしたら外れるかもしれません。

(無題) 削除/引用 No.3226-10 - 2010/09/20 (月) 19:30:33 - ATGC シャペロンか、そうだね、あるね、ありえるね、リコンビナントにくっ付いてくるのは普通はhsp70が多いけどちいさいのもあるからね。シャペロンなら蛋白質がレジンに結合した状態で、ATP含むバッファーでインキュベートすればとれるかもしれないね。

(無題) 削除/引用 No.3226-9 - 2010/09/20 (月) 18:42:21 - A まずそのついてまわっている蛋白質が分解産物であるかどうかですが 既に皆さんがアドバイスされているようにマススペクトルなりN末シーク エンスできればわかると思いますが、その前にお手軽なWBで確認できない のですか？ポリクロの抗体が手に入ればですが。 仮に分解産物であるとしてそれが抽出中に分解されているのか発現中に 既に分解を受けているのかの切り分けですが、Ni-NTAを使っているという ことは多分His-tagが付いているのですよね？ですからスモールスケールで いいので同じ培養で通常の抽出を行ったものとPBS+8M尿素で抽出したものを Ni-NTAを使って精製して比べればある程度予想が付くはずです。PBS+8M尿素 の条件であれば通常プロテアーゼも変性しているはずですから。またどれ ぐらい意味があるかわかりませんが通常の方法で抽出した溶液を室温なり 37度に置いて時間経過でその分解産物と思われるバンドが増え、目的の 大きさのバンドが減少するのであれば抽出時の分解の可能性を示唆できる かもしれません。もちろんこの場合はWBでの検出になります。 あとおおさんがおっしゃっているように時々分解産物でなくとも目的の 蛋白質と相互作用してしまい付いてまわる蛋白質もあります。この場合は 既にトピ主さんがされているように様々なカラムを試すか（まだHICや ハイドロキシアパタイトなどは試されていないですよね？）、塩濃度や界面 活性剤、グリセロールなどの添加物でその相互作用をなくすことができないか試してみるぐらいですか。この場合抽出時に添加する方法もありますし、 ゲルろ過時に添加する方法もあります。 蛋白質発現にどの大腸菌を使われているのかわかりませんが発現蛋白質の 分解が少なくなるように工夫されている大腸菌もあったはずですからそれを 試してみるのもひとつの手かもしれません。それがダメならコールド系など 他のベクターにのせかえるか思い切って発現系を酵母やバキュロなどに 変えてしまうか。あまり気がすすまないとは思いますが。

(無題) 削除/引用 No.3226-8 - 2010/09/20 (月) 12:08:24 - Boston 思いついた解決策は温度を下げる事くらいでした。それが駄目だとなると、分かりません。

(無題) 削除/引用 No.3226-7 - 2010/09/20 (月) 12:05:10 - Boston シャペロンの可能性はどうでしょうか。３０kDa くらいのものがあるのかは調べていませんが。

(無題) 削除/引用 No.3226-6 - 2010/09/19 (日) 21:04:33 - うめ プロテインシーケンサでN末読めば自分かどうかはわかりますが。

(無題) 削除/引用 No.3226-5 - 2010/09/18 (土) 19:17:39 - ATGC 精製品をMALDI-TOFF MSにかけてみて分子量みるのがいいかな。近接した２つの主要ピークが出るかもしれない。あんまり大きいとあれだけど30KDa ならぎりぎりいけるでしょ。電気泳動してからバンド切り出しでやると回収率低すぎとかSDSが邪魔するとかでたぶんできないから、電気泳動に回すまえのサンプルでみたほうがいいね。もしそれで分子量的に単一にみえるならば修飾とか、SDSのつき具合（なんか１次構造的には同じで同じ分子量だけど、蛋白質が完全に変性しないでゲル内で中途半端な２つのコンフォメーションをとってそういうダブレットバンドになるやつがたまにあるらしい。前に先生に聞いた。）とかそういうのかもしれない。修飾っぽい感じならゲル切り出して、プロテアーゼ消化してLC-MS/MSで分析するといい。

(無題) 削除/引用 No.3226-4 - 2010/09/18 (土) 14:55:00 - おお 培養条件についてはドラスティクな改善は見られるかどうかわかりませんが、ミニマムな培地(M9ベース)でやってみるとか、、、それなりに試せる方法はありそうですが、、、

(無題) 削除/引用 No.3226-3 - 2010/09/18 (土) 12:17:17 - モモ 精製の目的はなんでしょうか？ 極端な話、SDSPAGEでは分離できているんですよね。 バンドを切り取れば分けられますが、それではまずい実験なのですよね？ 問題のバンドをマスにかけてみれば何が起こっているかわかるかも。 そしたら、対処法を思いつくかもしれない。 （思いつかないかもしれないけど。）

(無題) 削除/引用 No.3226-2 - 2010/09/18 (土) 08:17:26 - おお まずは本当に分解産物であるという確信は何処から来てるんでしょうか。 Qカラムとかでも分けられないんですよね。ピークのいちとかずれているとかないでしょうか。 というのは気にすることは両者くっついていたら違う方法とっても分けづらいなぁと思ったりもします。 まず単純にN,C末両方にタグをつけて両末端がインタクトなものをとるというのが考えられますが、、、でも、くっついているものだったらそれでも厳しいですよね。

精製タンパク質分解について 削除/引用 No.3226-1 - 2010/09/18 (土) 07:27:11 - おーす ウイルス由来の30KDaぐらいのタンパク質を大腸菌で発現し、精製を行っています。ところで、菌体破砕した後、SDS−PAGEで確認すると目的バンドのすぐ下に別の太いバンドが見られます。さらにNi-NTA、Q、Heparin、ゲルろ過まで精製しても、したのバンドがずっと付いてきます。Lysisバッファー中にいつもProtease阻害剤を入れてますが。培養中の細胞の中ですでに分解されたことが考えられます。誘導かけた後の培養温度15度ぐらい下げても、効果は見られませんでした。 発現ベクターを変えたほうが良いでしょうか。解決策について教えてください。よろしくお願いします。

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