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なるほど 削除/引用 No.3219-10 - 2010/09/18 (土) 18:42:47 - だい おおさんへ なるほど、そう言われてみればそうですね。RNaseHの解説のところも読ませていただきましたが、PCRの条件をいくつか振ってみることもかなり大事なようです。今までPCRでこんなに苦戦したことがなかったために知りませんでしたが、とても勉強になりました。また、本当にレスが早くて助かりました。どうもありがとうございます。

(無題) 削除/引用 No.3219-9 - 2010/09/18 (土) 17:19:03 - おお http://www.kenkyuu.net/cgi-biotech2/biotechforum.cgi?mode=view;Code=826 RNase Hの解説はこちらとか、、、 RTのバッファーの組成がきになるなら、エタチンだけでいいと思います。でも DTTとかPCR酵素に入ってたりしますしRTのバッファーも、PCRのバッファーも同じぐらいのKClが入っているし(SSIIで比較したときですが)...

(無題) 削除/引用 No.3219-8 - 2010/09/18 (土) 16:46:51 - だい たくさんのアドバイス、どうもありがとうございます。 おおさんへ ある核内転写因子で、ストレスに応じてmRNAの途中がスプライスアウトされる遺伝子があり、そのアイソフォームの比を見ています。短いアイソフォームが多いほど細胞にストレスがかかっていることを示すのですが、毎回PCRをするごとに短いアイソフォームが増えていたり、長いアイソフォームが増えていたりします。教科書的には、両方を引っ掛けるプライマーでRTPCRをすれば競合でかかるため、双方の比を取るのが目的であればリアルタイムでやる必要もないと書かれていますが、やはり事はそう簡単ではないのですね。確かにsaturationしてしまうと比もわからなくなりますね。もう少しサイクル数など、工夫してみます。 RNaseHというのは知らないのですが、精製後のcDNA内のRNAのコンタミをなくす目的で使うのですか？不勉強ですみませんが、もしお時間があればお教えください。 Aさんへ cDNAがpurifyできないかと思ったのは、cDNA産物の中に含まれているRTだのbufferだのDTTだのがRT-PCRの結果に影響しているのではないかと懸念したためです。フェノクロなどでも十分除けると思いますし、ただサンプルをロスするのが怖く、あまり手をつけていません。もしフェノクロ・エタ沈などで精製すればより再現性のある結果が出るのであれば、やるべきですね。どうもありがとうございます。

(無題) 削除/引用 No.3219-7 - 2010/09/18 (土) 01:43:59 - おお サイズが正しそうでも、挙動が不可解な時はノンスペの可能性もあります。 シーケンスするか、制限酵素のマップどおり切れるかなどチェックする必要が あるかもしれません。 DNA/RNAハイブリッドの状態が保存後で違ったりして微妙に出方が違うかもしれません RNaseHを使ってなければ、一度試してみてもいいかもしれません。

(無題) 削除/引用 No.3219-6 - 2010/09/17 (金) 20:14:01 - a モンテカルロ効果かも 以下転載 モンテカルロ効果（Monte-Carlo effect）とは、非常に濃度の薄いmRNAやcDNAをテンプレートにしてPCRを行った時に、同じ条件で同じように実験してもPCRがかかったりかからなかったりする現象のことを言う（PNAS Vol. 92, pp. 3814-3818, 1995; FEBS Letters Vol. 512, pp. 152-156, 2002）。プライマーがテンプレートとなるcDNA またはmRNA にうまくアニールできればそこから新しいDNA鎖が伸長するわけだが、テンプレートの量が非常に少ないとプライマーがくっつく確率も低下する。PCRサイクルの初期にプライマーがうまくテンプレートにくっつけば、少ないテンプレートからスタートしてもある程度の量のPCR産物が増幅される。しかし、サイクルの初期にうまくくっつかないと、最終的に増幅される産物の量も少なくなる。PCR産物は2の階乗で増えていくから、初期の段階のほんの僅かの差が最終的にはとても大きな差を生むことになる。その結果、同じ量のテンプレートを用いてPCRをしてもうまくいく時と行かない時が出てくるのである。

(無題) 削除/引用 No.3219-5 - 2010/09/17 (金) 20:13:01 - A >もう一つ、基本的な質問ですがcDNAをカラムなどを通してDNAと同じように>purifyすることは可能ですか？ 理論的には可能なはずですが通常使われているcDNAの量ではおそらく殆ど カラムに付いて出てこなくなるのではないかと思います。もちろんcDNAが 山ほどあるのであればできるでしょうが。何を除きたいのかわかりませんが フェノクロ、エタ沈程度では除けないものですか？

(無題) 削除/引用 No.3219-4 - 2010/09/17 (金) 20:07:43 - stu ノンスペのバンドだったり、目的産物だったとしても濃度が薄いとそうなるような気がします。 ４０サイクルでギリギリ見えるレベルのバンドとか。

(無題) 削除/引用 No.3219-3 - 2010/09/17 (金) 17:24:10 - ats 同じ機械でも、チューブをセットする穴の位置・チューブの数でも温度変化の様子が異なるため、増幅効率が異なることがあります。古めの機械(＋ミネラルオイル）で真ん中あたりと端の方で顕著に異なったことを経験しています。 ある方から再現性を良くするため（DDW入り）ダミーチューブを入れていると聞いたことがあります。最近の機器はそのようなことが少ないと宣伝しているので、問題は少ないかも。

(無題) 削除/引用 No.3219-2 - 2010/09/17 (金) 11:38:43 - おお >スプライスアウトされる部分を挟み込むようなプライマーで長いバンドと短いバンドを競合で検出するようなPCRをかけると、それぞれのシグナルの比がやるごとに違うので、なかなか定量化できず、困っています。 これはエンドのスプライシングあいそフォームの発現比をみているんですよね。 一つは一回の実験でコントロールや比較対照にたいして、いつも同じあいそフォームが増えるなら、データーにすることは可能と思います。 もう一つはエチブロの感度に関係しますが、 PCRでエチブロで染まるぐらい増やすと、PCR自体にがサチュレーションしているサイクル数にさしかかっていることが多いです。なので定量性はいいにくくなります。 さらに、検出の時に明るい部分がサチュレーションした状態でカメラに納めていればさらに歪みがあるとおもいます。 定量を重要視するなら、リアルタイムでやるとか(この場合各あいそフォームにスペシフィックな複数のプライマーセットが必要ですが)、ラジオアクティブなPCRをするとか、工夫が必要かもしれません。

RT-PCRの再現性について 削除/引用 No.3219-1 - 2010/09/17 (金) 10:57:20 - だい ある細胞からmRNAを抽出し、RT-PCRをかけているのですが、同じcDNAサンプルから同じプライマーを用いて同じ機械で同じ条件でPCRをかけても、バンドの出方に再現性がないことを複数回経験しています。目的遺伝子によるのかと思っておりましたが、違う遺伝子でもやはり再現性がないことを経験します。 プライマーはイントロンを挟み込むようにデザインしているのでDNAがコンタミしていても引っかからないようにしています。RTなしのネガティブコントロールでPCRがかからないことも確認しています。その点では再現性がありますが、バンドの出方、位置などが微妙にずれることが多いです。スプライスアウトされる部分を挟み込むようなプライマーで長いバンドと短いバンドを競合で検出するようなPCRをかけると、それぞれのシグナルの比がやるごとに違うので、なかなか定量化できず、困っています。 みなさんは同じようなご経験がおありですか？また、解決する方法があれば教えていただけませんでしょうか？ もう一つ、基本的な質問ですがcDNAをカラムなどを通してDNAと同じようにpurifyすることは可能ですか？

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