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(無題) 削除/引用 No.3218-23 - 2010/09/22 (水) 12:02:39 - 口内炎 TK-1さん >２割しか入らないのは何か問題があると思います。 レトロでヒトのリンパ球でもうまくいくはずだということですね。 レトロのタイターは、多分ですが問題ないレベルにあると思います。 細胞に関しては抗ウイルス状態になっているとかなにかおかしくなっているかどうかはわからないです。 かかっているけどGFPが発現していないあるいは低すぎてわからないという可能性もあると思うのですが、それらを調べるのもなかなか手間がかかるので、今回は10-20％で我慢して先に進めたいと思います。

(無題) 削除/引用 No.3218-22 - 2010/09/22 (水) 11:50:52 - 口内炎 はまじさん いろいろと貴重な情報ありがとうございます。 おっしゃるとおり、他のリンパ球細胞で試してみれば、レトロのせいか、細胞のせいかある程度わかりますね。 ちょっと回りで持っているところがないか探してみます。 レンチベクターはAddgeneから買うとだいぶ安そうですね。 ボスを説得するのに役立ちそうです。

(無題) 削除/引用 No.3218-21 - 2010/09/22 (水) 11:01:33 - TK-1 > レトロとリンパ球の組み合わせでは2割以上は厳しいですか・・・ 10A1でマウスなら50-90％前後です。humanはHIV-baseを使うので比べられませんが、２割しか入らないのは何か問題があると思います。

(無題) 削除/引用 No.3218-20 - 2010/09/22 (水) 10:33:54 - 774 レトロなさん 私は293TにpLPCX等とパッケージングベクターpCL-10A1をトランスフェクションしてレトロウイルスを作成して、そのまま標的細胞にかけてました。 標的がリンパ球ではなくHeLaで、目的がライブラリーの導入ではなくstable細胞の樹立だったので、感染効率は測定しておりません。 （今回の系では参考にならず、申し訳ないです。） ちょうど、これからリンパ球にウイルスベクターを感染させる実験が必要になるので、皆様の情報を教えていただけたらと思った次第です。 レトロとリンパ球の組み合わせでは2割以上は厳しいですか・・・

ちょっと面倒なのですが 削除/引用 No.3218-19 - 2010/09/22 (水) 05:08:21 - はまじ 口内炎様 もしも、周りの方でTHP-1細胞を持っている方が居たら、お持ちのレトロの系でGFP陽性率をチェックされては如何でしょうか？もしレトロの系でTHP-1細胞への導入効率が低いままでしたら、レンチなどのベクター系を構築をする強い根拠になるかと思いました。もちろん、全然別のラボで行った、別のラボが所有するTHP-1細胞へのレンチベクターによる導入効率との比較なので正確であるとはとても言えないのですが。

今後のベクター選びのために 削除/引用 No.3218-18 - 2010/09/22 (水) 03:17:58 - はまじ 私が使っているレンチのシステムは、Addgeneで購入できるplko.1系列の物です（SIGMAでも購入できますが、Addgeneの方が安いはずです）。実際にはshRNA発現用のシステムですが、ピューロマイシン耐性遺伝子の発現ユニットも入っているのでここをいじると、タンパク発現にも使えないこともないです。この系列でGFPを発現するpLKO.3Gという物もAddgeneで購入できます。パッケージングはマニュアルの奨めるままpsPAX2とpMD2.Gを使用しています。粒子作製用の293Tは近所のラボから貰いました。なんだかAddgeneの回し者みたいになってしまいました。すみません。

(無題) 削除/引用 No.3218-17 - 2010/09/22 (水) 00:39:28 - 口内炎 amiさん 私が用いているのは株化細胞なので、ほっといてもどんどん増殖します。

私の理解だと 削除/引用 No.3218-16 - 2010/09/22 (水) 00:31:59 - ami >> あとは、ひょっとしたらなのですが、レトロウイルスの感染前に細胞に刺激などは行っていませんか？ > 普通に血清入りのメディウムで飼っているだけなので、刺激はしていません。 同じメディウムで飼っている他の細胞にはレトロが感染するので、刺激は入っていないと思います。。。多分。 レトロウィルスって、増殖期の細胞にしか導入されないんじゃないでしたっけ･･･リンパ球in vitroで刺激しないと、多分増殖しませんよね･･･

(無題) 削除/引用 No.3218-15 - 2010/09/22 (水) 00:08:38 - レトロな 774さんがどのようにさておられるのか、私も知りたいところです。レトロはリンパ系ではかなり厳しい（確かに2割くらいは入ります、でもそれ以上にはどうしてもいきません）という結論にうちではしてました。レンチでlibraryを作ればという話、確かにそうで、されていますね。ただ、あまりに感染力が強く、特にヒトにがんがん入るので、気持ち悪がってあまりされてないのかなという気がします。でもその気になればできるはずです。

(無題) 削除/引用 No.3218-14 - 2010/09/21 (火) 23:56:10 - 口内炎 おおさん、774さん > HTLVはレトロでTcell系に感染すると思うのだが、、その辺で何か打開策はないかなあ、、、 > HTLVは一般に、Virion放出（Cell free)よりは細胞間での手渡し（Cell to Cell)がメインの感染経路なので、他のレトロやレンチの方が感染効率はいいのではないかと思います。 VSV-Gをかぶった、HTLVベクターがあればいいかもですねー。 まあ結局レンチを使えばいいのかもしれないですけど。 774さん > 293Tなどにトランスフェクションして、ターゲットの細胞とco-cultureすれば効率はいいかもしれません。 > （ただ、その後の分離が難しいかも。） パッケージング細胞が混ざっていてもその後のスクリーニングで分けられるような気がするので、これはレトロでやってみようかなとも思っています。 > 今後のベクター選びの際の参考のために、 > レトロウイルスの具体的な名前を挙げて頂けると助かります。 ベクタープラスミドはpMXs(MMLV)使っています。 パッケージング細胞はPlat-GPです。

(無題) 削除/引用 No.3218-13 - 2010/09/21 (火) 23:39:48 - 口内炎 はまじさん はまじさんもレンチで問題なく感染出来たということですね。 レンチでライブラリーを作ってもいいかもしれませんね。報告もあるみたいですし。(J Virol. 2004 Oct;78(20):11352-9.) > 質問者様の使用している株化細胞が何らかの理由でレトロベクターで遺伝子導入しづらいという可能性もあります。この場合は可能であれば細胞を別の種類に変えればうまくいくかもしれません。 理由はここでは述べられませんが、私の実験の場合、ちょっと特殊な細胞を使っているので他の細胞を使うことは難しいのです。 > あとは、ひょっとしたらなのですが、レトロウイルスの感染前に細胞に刺激などは行っていませんか？ 普通に血清入りのメディウムで飼っているだけなので、刺激はしていません。 同じメディウムで飼っている他の細胞にはレトロが感染するので、刺激は入っていないと思います。。。多分。

(無題) 削除/引用 No.3218-12 - 2010/09/21 (火) 12:05:00 - 774 HTLVは一般に、Virion放出（Cell free)よりは細胞間での手渡し（Cell to Cell)がメインの感染経路なので、他のレトロやレンチの方が感染効率はいいのではないかと思います。 293Tなどにトランスフェクションして、ターゲットの細胞とco-cultureすれば効率はいいかもしれません。 （ただ、その後の分離が難しいかも。） 今後のベクター選びの際の参考のために、 レトロウイルスの具体的な名前を挙げて頂けると助かります。

(無題) 削除/引用 No.3218-11 - 2010/09/21 (火) 04:45:13 - おお HTLVはレトロでTcell系に感染すると思うのだが、、その辺で何か打開策はないかなあ、、、

レンチでの経験 削除/引用 No.3218-10 - 2010/09/21 (火) 03:33:39 - はまじ 私はレンチウイルスベクター（VSV-Gエンベロープ）しか使ったことがありませんが、 ＞はじめに書き忘れましたが、コントロールのGFP発現レトロをライブラリーレトロと同時に作って、リンパ球細胞とVeroなどの接着系の細胞にそれぞれかけた時は、接着系ではほ100％光るような量（6cm dish に上清1mlとか）をかけてもリンパ球細胞では1％程度です。 これと同様の実験を行ったことがあります。HeLaでほぼ100%GFPが光る量で、ヒト単球系THP-1細胞でも100%光りました（フローサイトメトリーで確認）。なので、私も少なくともヒトであればレンチの系はおすすめ出来ます。ちなみに初代培養リンパ球になると、効率がもの凄く低下します。レンチの系でも初代培養は大変です。 質問者様の使用している株化細胞が何らかの理由でレトロベクターで遺伝子導入しづらいという可能性もあります。この場合は可能であれば細胞を別の種類に変えればうまくいくかもしれません。 あとは、ひょっとしたらなのですが、レトロウイルスの感染前に細胞に刺激などは行っていませんか？私の経験ではレンチベクター感染前にインターフェロンガンマで刺激してしまうと、著しく効率が低下しました（100%→5%という劇的な変化でした）。おそらく抗ウイルス因子が発現してGFPの発現までのシステムを阻害したのだろうと考えています。もし刺激を行っていて、且つ可能ならば、ベクター感染後に刺激をすることでこれは回避できると思います。レンチベクター感染後にインターフェロンガンマで刺激をしてもGFPの効率は刺激無しと同等でした。

(無題) 削除/引用 No.3218-9 - 2010/09/19 (日) 10:05:35 - TK-1 >[Re:5] レトロなさんは書きました : > モモさん、レンチとレトロでは感染効率が全然違いますよ。確かにレトロではリンパ球系への感染効率は、どうやっても上がりません。やった限りではコートを替えても大した効果はありませんでした。レンチに替えればいいのですが、レンチだとヒト系にはよく入りますが、齧歯類細胞での感染効率は高くならない場合が多いという問題がありますね。レトロの受容体を入れたリンパ球を作ったほうが結果的に早い様な気がします。 レトロで濃縮無しでやっていますが、普通のマウスのリンパ球で80−90%程度の感染率は得られます。レトロだからリンパ球に入らないというのは少なくともマウスの場合はどうなんですかね。

(無題) 削除/引用 No.3218-8 - 2010/09/19 (日) 01:16:45 - 口内炎 レトロなさん > モモさん、レンチとレトロでは感染効率が全然違いますよ。 なるほど。非常に有益な情報ありがとうございます。 >レトロの受容体を入れたリンパ球を作ったほうが結果的に早い様な気がします。 私の細胞だと受容体を入れた細胞を作るのは、実験の都合でちょっと難しいかと思います。そこで追加の質問になってしまうのですが、cDNAライブラリーをいれたレンチってあまり見かけないのですがなんか理由があるのでしょうか？ モモさん なるほど。レトロなさんもおっしゃっていましたが、感染効率はレンチだとよさそうですね。検討してみます。 レトロのタイターそのものは、接着系の細胞に対しては問題ないレベルにあると思います。

(無題) 削除/引用 No.3218-7 - 2010/09/19 (日) 01:08:30 - 口内炎 酷暑さん ありがとうございます。 はじめに書き忘れましたが、コントロールのGFP発現レトロをライブラリーレトロと同時に作って、リンパ球細胞とVeroなどの接着系の細胞にそれぞれかけた時は、接着系ではほ100％光るような量（6cm dish に上清1mlとか）をかけてもリンパ球細胞では1％程度です。 ご指摘の通り繰り返し感染させると10-20％くらいにはなります。スケールを大きくしてそのまま進めてしまってもいいのですが、すぐに改善できる点があればなあと思っている次第です。 おおさん 酷暑さんのレスにも書きましたが、厳密なタイトレーションは行っていないのですが、なんとなくのタイトレーションは行っております。説明不足でした。

(無題) 削除/引用 No.3218-6 - 2010/09/18 (土) 21:43:39 - モモ レトロとレンチではそんなに違うんですね。 大変失礼しました。

(無題) 削除/引用 No.3218-5 - 2010/09/18 (土) 12:20:50 - レトロな モモさん、レンチとレトロでは感染効率が全然違いますよ。確かにレトロではリンパ球系への感染効率は、どうやっても上がりません。やった限りではコートを替えても大した効果はありませんでした。レンチに替えればいいのですが、レンチだとヒト系にはよく入りますが、齧歯類細胞での感染効率は高くならない場合が多いという問題がありますね。レトロの受容体を入れたリンパ球を作ったほうが結果的に早い様な気がします。

(無題) 削除/引用 No.3218-4 - 2010/09/18 (土) 12:01:16 - モモ レトロはほとんど使わないのですが、普段レンチでVSV-Gを使うと、 濃縮しなくてもT細胞系で７０％ぐらいは感染しています。 なので、１％以下というのはいくらなんでも低すぎるような気がします。 ウイルス産生細胞とハーベストのタイミングはどうでしょうか？

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