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(無題) 削除/引用 No.3215-10 - 2010/09/18 (土) 01:56:45 - おお DNAが原因なのかそのほかが原因なのか私は判断つきません。 DNAが大量にあるとお示しのような現象は起こります。 特に組織だと、細胞数でいえばそうとの量になっていると 言って良いでしょう(10cmシャーレ10枚以上とか)。 なので冷静に収量を見積もって必要なバッファー量を考えてみてください。 同時にDNA以外なら糖などの混入かもしれません。 余分な成分をじょきょしたいなら、まず核を単りして DNAを抽出するステップに入るといいかもしれません。 ていちょうな溶液に若干のデタージェント(NP-40 0.1-0.5%とか) を加えてホモジナイズして、遠心すると核は回収できます。

(無題) 削除/引用 No.3215-9 - 2010/09/16 (木) 23:42:24 - ami なんだか分からなかったんですけど、脾細胞のDNA抽出するときに、赤血球が入ったままやってたらなんかねばねばになって微妙でした。Ficollで分けたりしたらよくなった気がしました。･･･好中球のせいだった？

(無題) 削除/引用 No.3215-8 - 2010/09/16 (木) 23:40:15 - 774 SDSはfinal 0.1％でも問題ないです。というかそう書いてある本もあったと思います。 大量ということなので、１０％SDSをあらかじめ作っておいて、LysisBufferの1/100量加えるというのが楽でよいかもしれません。 私の時に問題が解決したのは色んな要因が重なりすぎてて完全には理由がわからないというのが正直なところです。 共通の試薬が新しくなったり、インキュベートの時間長くしたり、細胞とLysisBufferの割合を変えたり・・・ 的確な解決法を提案できなくて申し訳ないですが、色々頑張ってみてください。

(無題) 削除/引用 No.3215-7 - 2010/09/16 (木) 23:19:00 - MIKK 丁寧な説明、ありがとうございます。 やはりDNAではないですよね・・・ SDS(-)のLysisBを先に加える方法は行っていたのですが、LysisBとSDSの量やインキュベート法について教えて頂いた方法を参考に色々試してみようと思います。 助かりました。

あれはDNAの粘性ではないです。 削除/引用 No.3215-6 - 2010/09/16 (木) 22:43:22 - 774 私も今日全く同じ方法でgenomic DNAを回収しました。 さらに今まで同じ問題で困ったこともありました。 細胞をLysisBufferに懸濁する時にSDS(+)のLysisBufferを使用すると、細胞塊の外側が先に変性してしまい、Lysisに時間がかかってしまいます。 そのためbibleにもあると思いますが、LysisBufferはSDS(-)のものを使用して一度細胞を懸濁させてから、final 0.2％となるようにSDS溶液を加えるのが良いと思います。 ちなみにこちらもbibleにあると思いますが、使用するLysisBufferの量は溶かしたい細胞体積の(たしか)４０倍とかを使用すると良いです。 もうひとつ上記と関連するのですが、おそらく時間をかければゲル状のものは無くなるかもしれません。５６℃ O/Nとか。 私が細胞からやる場合を書いてみますので参考になればと思います。 経験から細胞数は測定していないので申し訳ないのですが、６�pDishコンフルの細胞を回収し、エッペン２つに分ける。それぞれに５００μｌのLysisBufferを加えて懸濁し、そののちproKとSDSを加える。５６℃でO/Nでshakeする。

(無題) 削除/引用 No.3215-5 - 2010/09/16 (木) 22:32:04 - うーん そうでしたか、勘違い申し訳ありません。 >特殊な目的 これをもう少し明確にお示しになられますと経験があられる方からアドバイスが貰えるかもしれませんね。

(無題) 削除/引用 No.3215-4 - 2010/09/16 (木) 22:26:41 - MIKK 回答ありがとうございます。 私の場合、目的がPCRやサザンではない特殊な目的のため、ある程度精製されたDNAが大量に必要だという事情がありまして・・・ 実際に細胞はかなり入れています。 大量に取りたい場合、最も効率の良い細胞数とLysysBの比率ってどのくらいなんでしょうか？ DNA溶液が粘性を持つことは知っています。しかし、そのゲル状の物体はSDSを添加した瞬間から現れて、エタノールにも水にも溶けず、最後まで残っていますので、その他のものだと思っていたのですが・・・ やはりどうしようもないでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.3215-3 - 2010/09/16 (木) 21:43:43 - UUUU おそらくこのトピを見たひとのほとんどの人が思うと思うので、聞いておきますが、 ゲノムが多量にあり粘性になっているのではないでしょうか？ 細胞いれすぎでは？

(無題) 削除/引用 No.3215-2 - 2010/09/16 (木) 21:35:33 - うーん 今日私も全く同じ実験を行っています。 私はただのgenotyping目的ですので、1x10^5個ほどの脾臓細胞を遠心してpelletにした後、 DW 50 ulほど加えて95度, 10 min ProK 15 ulほど加えて55度, 60 min あとはこの65 ulの溶液の1 ulを25 ul scaleでPCRを行っています。 トピ主さんはgenomic PCRを取りたいんですよね。目的はPCRなどですかね？

マウス細胞からのDNA抽出 削除/引用 No.3215-1 - 2010/09/16 (木) 20:40:01 - MIKK マウス脾臓細胞からProK融解→フェノクロという方法でDNA抽出を行っているのですが、最初のLysysバッファー中のSDSによって細胞がゲル状？になってしまい、以降の操作が極めて難しくなってしまっています。 対処方法やSDSを使わずに抽出が可能かどうかなど、ご存知の方おられましたらお教え下さい。

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