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(無題) 削除/引用 No.3211-10 - 2010/09/16 (木) 23:18:28 - ザンギ たぶん質問者の方はあまりPCRの経験がないのでしょうね。 例えば論文に書いてあるプライマーを使って、同じ鋳型プラスミド、同じPCR装置 を使ってもPCR酵素が違えば最適な反応条件は全く違ってしまいます。 プライマーの配列は配列特異性を確保するには重要ですけども、それ以外は 参考程度と思ったほうがいいです。 要するに、ラボで実績のないPCR系を立ち上げるなら一度は条件検討をしてみな いといけません。 質問者の方がラッキーなのは他所の機械を借りられたので、少なくともプラ イマーと試薬には問題がないことが確認できてることですね。 あとは装置にあったサイクル反応条件だけです。 「長い」PCRは個人的には１ｋｂｐを目安にしています。

(無題) 削除/引用 No.3211-9 - 2010/09/16 (木) 20:37:35 - おお わたしは菌体を壊す時間を取ったことがないですね。 普通のpcrの条件でやってました。 マシーンの違いで少し条件にさがでたため、片一方で増えないと言うのが現状のようです。 ほかの方の指摘にもありますように、けっこう条件を選ぶプライマー、あるいはテンプレートを使っているのかもしれません。 条件を若干かえるとかかる可能性はあると思います。アニーリングの温度を上下に振ってみる、アニーリング時間を30sぐらいまで伸ばす、サイクル数の延長くらいはやってもいいかもしれません。さいきんPCRは条件を決めるのがめんどくさいのでタッチダウンでやることが増えました。 プライマーも設計しなおして、簡単にふえる様にするてもあるかもしれません。 どれくらいの頻度でその実験をやるのかがネックになるかもしれませんが、その実験に関してはPCRマシーン借りて実験をすすめ、同時に自分のらぼのマシーンで動く条件を探る様にするのが言いように思えます。 増やすサイズは150-300bpあたりくらいがいいと思います。短い方が増えるのに有利です。

(無題) 削除/引用 No.3211-8 - 2010/09/16 (木) 19:52:36 - mom-a FUJIさんのラボにあるサーマルサイクラ(A)ーで増幅しなかった。 ↓ サーマルサイクラーに問題があるのか？と思い、知り合いのラボ(B)でも実験を行った。同時に同じサンプルを分けたもので（A)でも実験した。 結果、Bでは増幅したがAでは増幅しなかった。 ↓ やはりサーマルサイクラーの問題かと思い、修理に出した。 が、代替機(Aと同機種ですよね？)でもやはり増幅しない。 ↓ 今後、ラボにあるAが使えないのでは困るので、どうにかしたい。 という理解で、OKでしょうか？ 同じ温度に設定すれば、一応同じ温度になってくれないと困りますが、ザンギさんのおっしゃるように温度の上下にかかる時間などが違いますから、同じ条件では上手くいかないことはよくあるようです。 条件検討の結果、違う温度の方が上手くいく、ということもあるかもしれません。もちろん、時間の設定を変更するのもよいかもしれません。 colonyPCRでなくても良ければ、ミニプレップしてからPCRするというのは？

皆様、ありがとうございます。 削除/引用 No.3211-7 - 2010/09/16 (木) 19:06:54 - FUJI ~ さん＞ 機械が違っていても設定が同じであれば温度も同じだと思い込んでいました。 もう一度温度は検討してみたいと思います。 おおさん＞ 装置は全く違います。 自分たちの持っているサーマルサイクラーで上手くいかなかったので 検証実験のために知り合いのラボで同時に実験を行ったので二台使いました。 ザンギさん＞ ありがとうございます。 時間の検討もおこなってみます。 菌の量が多いと増えないことがあるのは知っていたのですが、別のサーマルサイクラーで増幅したためにプレートからダイレクトでの実験しか行っていませんでした。それも検討してみます。 また、長いプロダクトとはどの程度からでしょうか？ みみさん＞ 研究室としてPCRのポジコンを持っていないので検証できていません。 しかし、大腸菌に導入するための目的配列は増やすことが出来ました。 Aさん＞ 私たちのラボもアニーリング温度は55℃で行っています。 菌体を壊す時間は10分としていたので15分も検証したいと思います。

(無題) 削除/引用 No.3211-6 - 2010/09/16 (木) 16:31:49 - A ザンギさんがおっしゃるように菌体が多すぎてうまく行かなかったこと があります。チップの先で目的のコロニーに触って100uLのDWに溶いた後 1uLをテンプレートにすれば問題ないはずです。サイクルに入る前の最初の 変性は菌体を壊すために15分は取った方がいいかと思います。あとは当た りのコロニーなら増えるのがわかっていますからアニーリングの温度を ちょっと低めに設定してもOKなはずです。コロニーPCRをする場合私は大抵 アニーリング温度を55度固定ででやっていますが、温度の問題でうまくい かなかったことはありません。

(無題) 削除/引用 No.3211-5 - 2010/09/16 (木) 13:39:13 - みみ プラスミドとかのポジコンも増えないのですか？

(無題) 削除/引用 No.3211-4 - 2010/09/16 (木) 13:26:32 - ザンギ 装置が違うと増えなくなることは、条件のシビアな場合に時々あります。 温度制御の加熱冷却能力によって温度変化速度が違うのが主な理由です。 普通コロニーPCRは何でも増える緩い条件でやるので、問題になることは あまりありませんが、長いプロダクトを増やすときにはあるかもしれませんね。 各サイクルの時間条件を少し長めにとってやるといいかもしれません。 余談ですが、コロニーPCRでは菌体量が多すぎると増えませんから注意し てください。

(無題) 削除/引用 No.3211-3 - 2010/09/16 (木) 12:26:09 - おお 増えるやつと増えないやつ、マシーンの型は一諸ですか? 2台どうしても使わないといけないのでしょうか?

(無題) 削除/引用 No.3211-2 - 2010/09/16 (木) 12:13:24 - ~ 増えないほうのサーマルサイクラーで温度の条件検討はしましたか？ おなじ設定をしたからといって、同じ温度になっているとは限らないでしょう。

colony PCRについて 削除/引用 No.3211-1 - 2010/09/16 (木) 12:01:38 - FUJI 初歩で詰まっています。 20μLに調整したPCR溶液に大腸菌をプレートから溶かした後に 10μLに分けて二つのサーマルサイクラーで増幅させました。 酵素はExtaqを使っています。 その結果、片方の機械では増幅が確認できましたが、もう一方の機械では増幅が確認できませんでした。 上記の結果より実験系は働いているようなので、サーマルサイクラーが原因であると考えて修理に出し、現在は業者より借りた代替機を借りています。 しかし、修理前の機械を使った時と同じで代替機を用いても増幅を確認できませんでした。 前回と同じく、同時に行った別の機械では増幅に成功しています。 チューブが純正品ではなかったので、純正のものを使っての増幅も試みましたが失敗しました。 現在、打つ手が無く困っています。 何かアドバイスがありましたら、よろしくお願いします。 どこまで書いてよいのか分からなかったので、不足している条件がありましたらご指摘よろしくお願いします。

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