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(無題) 削除/引用 No.3208-13 - 2010/09/17 (金) 01:40:55 - ami 力加減たぶんそれほど問題ではない。細胞密度は大きな問題。

(無題) 削除/引用 No.3208-12 - 2010/09/17 (金) 01:37:46 - ami 【ヒント】培地の色は何を意味しているでしょうか。どうして、培地の色が変わる仕組みにしてあるでしょうか。 などなど、検討してみるべき項目は非常にたくさんあると思いますので、あまり具体的に書くのもあれかもしれない。 経験も多少は要されることなので、自分で慣れていくよりないとも思います。でもとりあえず、48hごとは面倒見なさすぎだと思う。24hごとに見ていても、ときどきやばいことがある。数もぎゅうぎゅう詰めすぎると思う。うまくなっても、たぶん１ヶ月くらいだと思う、最長。 ･･･網羅的に書くには、Tipsが多すぎる。書いてみて思った。たぶん、どこか、同じような実験やっているラボに連絡つけて、一通り見てくるほうが100倍早い。 > カウントすると確かに増えています Ｔリンパ球は、増殖能やサイトカイン放出能を失ってしばらくの間は、トリパンブルーでは生細胞に見える。。

(無題) 削除/引用 No.3208-11 - 2010/09/17 (金) 01:30:38 - ゆず-ぽんず 皆様回答ありがとうございます。 まず、当方の所属している研究室、BOSS以外にと助手の先生が1名いらっしゃいます。先輩ですが、自分の代が頭のためいない状態です。 また隣の研究室は分野がかけ離れており細胞培養や免疫系の類の実験は行っておりません。 加えてボスに意見を求めようとすると具体的な打開策ではなく「それは君の手つきが乱暴で、悪いからだ」と毎回指摘を頂く日々が続きます。 実際自分自身、知識・技量ともにまだまだ未熟なのは重々承知しています。 ですが、もしプロトコールや培養条件に問題がある場合、プロトコールが絶対正しいと確信しているボスからはその問題を打開しうるアドバイス(すなわち改善すべきプロトコールの箇所の指摘)を頂ける気配が無い為、この場をお借りして皆様の意見を頂戴したいと考えた次第です。 これをご覧になられた方たちは何らかの分野で細胞や免疫系に携わる仕事をなさっている方々と思います。 少しでも助力を頂けると幸いです。 【疑問点】 書き方が抽象的ではありますが今特に知りたいのは以下の2つになります。 �@リンパ球を扱う際の力加減。 (比較対象になるかわかりませんが、当方、癌細胞程度なら継代培養は出来ます。加えてリンパ球培養8日目くらいまでは死細胞もそれほど目立ちません。個人的には日頃からそれほど乱暴なピペッティングを行っているつもりはないのですが、リンパ球とは継代の際、相当繊細な扱いが求められるものなのでしょうか。) �AIL-12で活性化させているCD4+リンパ球(抹消血由来)はどの程度の期間増殖し続けるのか。 ご教授お願いします。

(無題) 削除/引用 No.3208-10 - 2010/09/16 (木) 23:30:09 - ゆず-ぽんず うーんさん、amiさん回答頂きありがとうございます。 リンパ球のテロメアに関してですがエビデンスなどは特になく教授が言っている、といった具合程度です。 個人で調べても「テロメアが無い」や「抹消由来のリンパ球が無限に増える」などの記述は見かけないため信憑性に疑問を感じておりました。お二人の意見が聞けて良かったです。 たびたびすみません。以下に伺いたいことを書かせて頂きました。 文章がまとまらず少々長くなってしまいますが今一度おつきあいください。 >うーんさん CD4+の分離方法に関してですがおっしゃる通り末梢血由来です。 MACSを用いてのnegative selectionで分離を行っております。 U(ﾕﾆｯﾄ)の表記に関してですが製品説明書にはUは書いてありませんでした。恥ずかしながらﾕﾆｯﾄに関して十分に理解しておらず測り方を存じません。計算方法などがあるのでしょうか。 培養に慣れている方でも細胞の状態によって死んでしまったり増えないことも起こり得るのですね。そのような事態を避けるためにCriticalな条件や作業等がありましたら教えていただきたいです。 >amiさん 差支えなければ「長生きさせる工夫」を教えていただけると助かります。 加えて活性化させたリンパ球は何日程度生存するのかに関しても amiさんの考えを聞かせていただきたいです。 刺激の有無に関してですが 培養中の細胞を顕微鏡で観察すると 培養初期はほぼ全ての細胞に肥大化や分裂過程の途中でる様子が確認できます。 ですが問題の日数になってくると見た目、小さく丸まった細胞が目立ち始め ているように感じられます。 密度に関してですが ご指摘の通り、レモンイエローになっている日はカウントすると確かに増えています。一方、48時間経過にもかかわらずあまり培養液の色に変化のない日はカウントすると細胞数が横ばいや減少していて、死細胞も多くみられる次第です。 --------------- 加えて、お二人から指摘を頂いたIL-2の添加に関してですが 本日、教授に提案してみましたところ 「IL-2を加えると確かに増殖はするがTh2側に傾いているCD4+ Tcellまで無秩序に増えるので分化誘導の時には向かない、そもそもCD3/28で十分である。」と回答をいただきました。

(無題) 削除/引用 No.3208-9 - 2010/09/16 (木) 12:57:15 - MP > 【疑問点】 > ・刺激を与えて培養しているリンパ球は永久的に増え続けるのか hTERTを導入することによって（つまりテロメアをのばす）増殖回数が増えるという論文はちらほらありますね。 ただ最終的にp16やp21の発現が上がってきて増殖は止まるようです。

(無題) 削除/引用 No.3208-8 - 2010/09/16 (木) 11:31:51 - おお 半永久的に増えるって診断してないだけで白血病かもしれない。

(無題) 削除/引用 No.3208-7 - 2010/09/16 (木) 11:05:47 - う そこまで深読みするなら、 そう聞いたからといって、 はずかしげもなくそう書く質問者様の力量まで 深読みするべき、かと。 IL-2が必要とか言って、どうそれを質問者様は実行できるのだね？ とりあえず、もうちょっと直接聞ける人に教わることが先決かと。

(無題) 削除/引用 No.3208-6 - 2010/09/16 (木) 09:28:30 - ami > ってことは、 ゆず-ぽんずさんは そういうことを専門にやっている研究室に所属しているということですね。 そういうことを専門にやっているラボなら、テロメアないとか、半永久的に増えるとか言わないと思ったので丁寧に答えてみた感じです。深読みしすぎ？

(無題) 削除/引用 No.3208-5 - 2010/09/16 (木) 09:19:09 - おお >当研究室のボスに聞くとリンパ球にはテロメアがないため半永久的に増え続けると指摘を受けました あ、、、、、 T-cellで増殖シグナルでテロレースが活性化するよ。 テロメアが ないのに、 ないのに ないのに .... ボスにきいてみる?

(無題) 削除/引用 No.3208-4 - 2010/09/16 (木) 08:53:26 - まず ってことは、 ゆず-ぽんずさんは そういうことを専門にやっている研究室に所属しているということですね。 研究室の先生、もしくはポスドク、先輩にしつこくアドバイスを求める。 これに尽きます。 こんなところで、偉そうなことを言うだけで悦に入っている人に聞くより その方が有意義！！！

(無題) 削除/引用 No.3208-3 - 2010/09/15 (水) 21:53:45 - ami ・刺激を与えて培養しているリンパ球は永久的に増え続けるのか んなことはないです。経験的に。クローン取るときとかはいろいろ工夫して長生きするようにしてますけど。 ・根本的にやり方に不備があるのか ○ IL-2必要だと思います。たぶん。まぁCD4+は結構自分でもつくりますけど。 ○ 固相化できてるか確認しましたか？細胞は大きくなったり、数が増えたりしているのでしょうか。ちゃんと刺激が入っていると、見た目、直径が３倍くらいになるはずですが。 ○ 密度高すぎませんか。1x10^6個/mlで蒔いて48hたつと、ちゃんと刺激が入っているリンパ球なら、Mediumが目も当てられないほどレモンイエローになると思います。

(無題) 削除/引用 No.3208-2 - 2010/09/15 (水) 21:33:45 - うーん ゆず-ぽんずですか〜もうそんな季節なんですねえ。って違うか いくつか、質問があります。 健常人より採取ということは、末梢血由来ですね。 ・CD4陽性細胞はどのようにenrichされていますか？MACS？negative sort？ 　それともパーコールかなにかで分けたPBMCsを使用しているだけ？ ・確かにCD3/CD28で叩けば増えますが、IL-2は入れなくても大丈夫ですか？ 私もCTL誘導を行いますが、増殖目的のために3/28だけでなくIL-2を加えます。 IL-12でTh1へ分化誘導ということですので、増殖から分化の方へ行ってしますのですかね。 原因不明で突然増えず、死んでしまうことはあります。接着細胞がコンタミしていると増えない場合もありますし、刺激がchronicに入り続けるためexhaustしてしまい増えないこともよくあるかなと思います。 それからIL-12などの単位はU（ユニット）表記の方がみなさんにとっていいのかも。 というか、（ヒト）リンパ球にテロメアがないとは初めて聞きました破、evidenceはあるのであればご紹介していただけないでしょうか？ちょこっとググるとリンパ球でのテロメアを研究されている方もいらっしゃるようですが、、、 答えになってなくてすみません。

リンパ球培養で細胞が死んでしまいます。 削除/引用 No.3208-1 - 2010/09/15 (水) 20:40:30 - ゆず-ぽんず いつもお世話になっています。 当方、大学院で免疫系の実験を行っている学生です。 健常人より採取したCD4陽性細胞からのTh1細胞への誘導を行っているのですが 培養10日目を過ぎた頃から毎回、死細胞が目立ち始め細胞数が増えない状態です。同じ頃を境に細胞数の減少がみられるので寿命なのか?と思いましたが 当研究室のボスに聞くとリンパ球にはテロメアがないため半永久的に増え続けると指摘を受けました。 そこで 【疑問点】 ・刺激を与えて培養しているリンパ球は永久的に増え続けるのか ・根本的にやり方に不備があるのか をお聞かせください。 以下に培養時の条件を記しますのでご教授お願いします。 【条件】 ・抗CD3抗体と抗CD28抗体を37°Cで2時間インキュベートし固相化を行なった後、過剰量の抗体をMEDIUMで1度洗い流しています。そこへ ・1x10の6乗個/mL の濃度でCD4陽性細胞をMEDIUMに懸濁し、 ・IL-12を10ng/mL の濃度で添加しています。　 以降48時間ごとに継代を行っています。

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