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みなさん、ありがとうございます 削除/引用 No.3207-14 - 2010/09/21 (火) 10:30:36 - せいた お礼のメッセージが遅くなってすみません。 たくさんのアドバイスありがとうございます。 とても参考になりました。 こちらの都合で経費をかけずに実験したいので、 新しいゲルを購入をすることが出来ないんです…。 昨日、脱気時間を１０分にして作成してところ、 うまくいきました！！ まだ分子量を求めてはいないので 正確かどうかはわからないのですが… 今までで一番きれいなバンドになりました。 ありがとうございました。

(無題) 削除/引用 No.3207-13 - 2010/09/18 (土) 01:55:16 - 東海岸ポスドク 今のラボではBioradの4-20%のプレキャストゲルを使っていますので、買えるなら買った方が楽かもしれません。そもそも20%にしないと見れないような小分子の場合はTris-Glycine系よりもTris-Tricine系の方が良いと思いますよ。3-4kDaまで泳動可能です。

(無題) 削除/引用 No.3207-12 - 2010/09/16 (木) 23:10:29 - ATCG 確かに脱気長すぎだね。単に面倒だからしてない自分が言うのもあれなんだが。でも長いね。5〜10分で十分だね。ゲルのSDSはいれたほうがいいとおもうよ。入れない方がむしろきれいという人もいるけどね。この前暑くてゲル作るのが無性に嫌になってついつい誘惑に負けてプレキャストゲル（SDSなし）を内緒でつかったら、15KDaに出るはずの蛋白質が50KDa〜高分子量の辺に出た。それでびっくりして次の日home madeのゲルでやったらちゃんと15KDaにでた。gel入ってSDSが足りなくなるとどうもポリメライズするみたいなんだ。たまにこういうのもあるから入れた方がいいよ。上と下でpHが違うのもあれはあれで濃縮の強化の意味あると思うから自分はいいとおもうんだが駄目かな。サンプルバッファーと上のゲルの境目のところでも濃縮されるからいらないと言えばそうかもしれないでど、サンプルバッファーのpHは試料によっては動くしそのときいちいちpHを測って再調整できないでしょ。酸沈殿やってアセトン洗いしても酸のこってて黄色くなったらトリスとか適当な量入れて青くなったらよしOKとかでやるし。だから２カ所で濃縮はそれはそれで意味あると思う。もともとデイビスだったかだれかえらい人が改良して不連続緩衝系と名前付けたくらいだし。

(無題) 削除/引用 No.3207-11 - 2010/09/16 (木) 17:37:21 - よこ ひとつには脱気の時間が長すぎると思います。それだけ長くやると水が飛ぶのでゲル濃度が２０％を超えているでしょう。そもそも、脱気が必要というのは、ゲルの中にSDSを入れる、分離ゲルと濃縮ゲルのpHは異なるものにする、というのと並ぶ、電気泳動３大神話のひとつです。 APやTEMEDの量は、心配でしたら、１０％ゲルの半分程度にすればいいはずです。それくらいはやってみましょう。これくらいで特注というのはすごいですね。そんな時代が来たのかと思いました。

(無題) 削除/引用 No.3207-10 - 2010/09/16 (木) 17:28:39 - Kanata APSとTEMEDの量は普通のゲル濃度でも人によって違いますよね。 せいたさんが普段どれくらいの量を使っているのかわからないので, 1/5が少なすぎるかどうかはわかりません。 まずTEMEDとAPSが新しいものであると仮定します。 （ガラス板やスペーサーを念入りに洗ってきれいであることを確認） 12％ゲル調製時はゲル溶液に対して10% APS 1%, TEMED 0.1% で重合していましたが、20％のときは10% APS 0.25%, TEMED 0.125% で重合していました。ATCGさんがコメントされたように早く固めるとゲルがおかしくなることが多かったので、減らしました。 私たちはこの条件で上手くいきましたが、他にも要因はあるかと思います。 いろいろ試してみてください。 予算の問題はありますが、通りすがりさんが書かれたようにプレキャストを使うのもいい方法だと思います。

ありがとうございます 削除/引用 No.3207-9 - 2010/09/16 (木) 11:11:47 - せいた みなさんありがとうございました。 ガラスを丁寧にエタノールでふくなど、 自分の手順を再確認しながら、実行していきます。 ところで、あまりお聞きしてはいけないことかもしれないですが kanataさんが作成してときはどれくらい条件を変えられましたか？ 参考のため、加えた試薬の量を教えて頂けないでしょうか？ 今、APSの量を1/5に減らして作成しているのですが うまくいかず…減らしすぎということもあるのでしょうか。

(無題) 削除/引用 No.3207-8 - 2010/09/16 (木) 09:46:52 - 通りすがり 自分で条件検討するより、特注プレキャストゲル買った方が早くないですか？ 20%ゲルを作ることが実験ではないはずなので 特注することに少し経費を掛けた方いいように思うのですが・・・・

(無題) 削除/引用 No.3207-7 - 2010/09/15 (水) 21:42:48 - Kanata 20%ゲルを昔使ってました。 重合時の発熱が著しかったので、TEMED/APSの量を変えたり、冷却しながら重合させたりして作りました（時間はかかります）。そのあたり、条件をいじってみてはいかがでしょうか。

(無題) 削除/引用 No.3207-6 - 2010/09/15 (水) 20:38:54 - ATCG 20%は知らないけど、すごい前、18％　作った。そのときはいつもよりあったかいというか熱いみたいな感じだったけど泡とかそういうのは特になくて普通にできた、もちろん面倒なので脱気しないでやった（いまも脱気してない）。変な感じになるのは固まるのが早すぎるのかな？早すぎだとゲルの出来がよくないみたいだね。APSとかTEMEDを半分くらいオアもっと少なくしたらどう。ガラス板が汚れてるとゲル作る時いろいろトラブルおきやすいよ。きれいと思っても一応柔らかいスポンジ使って水で良く洗ってから、70%エタノルで拭いて乾かしてから使った方がいい。

(無題) 削除/引用 No.3207-5 - 2010/09/15 (水) 19:14:14 - ザンギ >[Re:1] せいたさんは書きました : > 現在、私は、20%ゲル濃度を作成しているのですが、うまくいきません。 > > ゲル化中にありの巣のような気泡が生じてしまったり、 ガラス板に張り付いてるような気泡なら泳動には影響しないと思います。 気になるなら重合するときにスラブごと水槽にいれてみてくだい。 ゲルが重合するときの反応熱による温度変化で膨張したり縮んだりするのが 原因です。 ゲルが固まらないのはスペーサーやガラス板が汚れてるからかも。

こんなのもありましたよ。 削除/引用 No.3207-4 - 2010/09/15 (水) 18:33:19 - mom-a http://www.kenkyuu.net/cgi-biotech2/biotechforum.cgi?mode=view;Code=937 できないことはなさそうですが…。

(無題) 削除/引用 No.3207-3 - 2010/09/15 (水) 18:12:51 - せいた そうなんですか… 1時間30分の脱気をしています。

(無題) 削除/引用 No.3207-2 - 2010/09/15 (水) 16:58:56 - A 2-20%のグラディエントゲルはみたことがありますが20%のゲルを作成した ことも見たこともが無いので実際にできるのかどうかはわかりませんが、 溶液の脱気はしていますか？

電気泳動　ゲル濃度20%作成について 削除/引用 No.3207-1 - 2010/09/15 (水) 16:52:48 - せいた 現在、私は、20%ゲル濃度を作成しているのですが、うまくいきません。 ゲル化中にありの巣のような気泡が生じてしまったり、 ゲルの下層からも離水して、ゲルと水の中間層のようなものが 生じてしまいます。 APSの量を減らすといった対処をしているのですが、 なかなか改善されません。 どのように作成すればよいでしょうか？ 作成中に気をつけることがあれば、教えてください。 お願いします。

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