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どうもありがとうございます 削除/引用 No.3203-4 - 2010/09/17 (金) 10:46:39 - だい 皆様、建設的なご意見をどうもありがとうございました。確かにおっしゃるとおりですね。凍結融解をすることで今のところウェスタンも含めてシグナルが強くなり、よい結果となっているので今回に関しては総タンパク量が多くなったことが目的タンパクの増量につながっているのだと思います。しかし、ご指摘いただいたようなことも含めて考えることは当たり前ですが大事ですね。どうもありがとうございました。

(無題) 削除/引用 No.3203-3 - 2010/09/15 (水) 12:37:31 - み 凍結融解で抽出されやすくなることは経験しています（っというか当たり前のような気がしますが）。抽出効率上げるためにあえて凍結融解する人もいますから。 しかし、細胞ボリュームあたり十分量のRIPAで抽出操作をされているのかが疑問点としてあります。 また、sonication、26Gの注射針を付けたシリンジに通して破砕する、しばらく転倒混合するなどの方法を取り入れるのも抽出効率を上げる手段でしょう。

(無題) 削除/引用 No.3203-2 - 2010/09/15 (水) 10:45:32 - おお そんなドラスティックにかわるもんでしょうかね。そう言う経験はありませんから具体的にどれくらいかわるかはよくわかりませんでした。 凍結したら細胞は壊れます。RIPAであれば細胞膜はほぼ完全に解けるでしょうし、残るのは核マトリクス、染色体あたりの構造くらいでないでしょうか。それが凍結した前と後で違うために溶出の度合いが違ってくる。なので蛋白量が増えたからといって、目的のタンパク質がよりよく抽出されたとは限りませんよ。 うまくいってればそれでいいですけどね。 どれくらいの分量でどれくらいの細胞を解かしているかわかりませんけど、まずRIPAで完全に溶出されるものなのかとかも検討してみるのもやってなかったら考えて見るべきです。 RIPAで 細胞を倍量にしてもそんなに溶出効果がトータルでなくても、目的のものの溶出ができていればラッキーだという考え方もあります。 逆にそうしても目的の蛋白の溶出効果が変わらないと思うならsdsを0.2%デオキシコール酸を0.5%まであげるか、0.5%CHAPSにかえてるなどで蛋白量は上がると思います。塩濃度を上げると出てくるタンパク質もかなりあります。 いいたいことは溶出されたそうタンパク質量がおおいからあなたの目的の蛋白量がが多く溶出されたとはいえず、溶出したそう蛋白質量が少なくてもあなたの目的のタンパク質が効率的に溶出されていれば検出に有利です。 >また、この方法で目標になるタンパクが壊れてしまうリスクはありますでしょうか？ あまり気にしない人は多いと思いますが、プロテアーゼアタックを考えると最初に示された条件とは違う環境にあなたのタンパク質はおかれますので全くその可能性がないとは言い切れません。 安定性に大きなさがないタンパク質はかなりあると思います

細胞抽出液のタンパク濃度を濃くする方法 削除/引用 No.3203-1 - 2010/09/15 (水) 10:04:23 - だい 今、細胞にある遺伝子を導入し、発現をウェスタンブロットで確認する作業をしています。RIPA bufferで細胞を溶解しているのですが、直接ディッシュに浸るようにbufferを加えるとどうしてもある程度の量が必要になり、その結果タンパク濃度が1.5μg/μl以上あがりません。 totalで30μg位流したいと思っているので、もう少し濃いタンパク抽出液が欲しいと思い、PBSで物理的に剥離した細胞をエッペンに集め、遠心したあとに指ではじいて細胞をばらばらにし、いつもの半量のRIPAで溶解しましたが、なかなか思ったほど濃度があがりませんでした。 ところが、たまたま細胞を凍結してあったサンプルを融解してから同じ半量のRIPAで溶いたところ、非常に濃いサンプルを得ることができました。 このように、細胞を凍結融解することでタンパク濃度が上昇した経験を皆様はお持ちでいらっしゃいますか？そのまま加えると溶け切らなかった内部の方の細胞が凍結融解によって壊れやすくなり、RIPAに溶けやすくなったという理解でよいのでしょうか？また、この方法で目標になるタンパクが壊れてしまうリスクはありますでしょうか？ ご経験のある方、教えていただけると助かります。どうぞよろしくお願いいたします。

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