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(無題) 削除/引用 No.3193-20 - 2010/09/15 (水) 10:19:42 - コンタミ おおさん お返事ありがとうございました。 培地の色には変化が見られないので大腸菌ではないかもしれません。 ATGCさん お返事ありがとうございます。 たしかに何かが動きまわっている感じです。 他のラボから譲ってもらった細胞なので、輸送の際のコンタミした可能性が一番高いと考えられます。 今回のことを正直に話して、もう一度細胞を譲ってもらえないかお願いするのが一番の解決策ではないかなと思っています。 仮に、輸送前の細胞自体がすでにコンタミしていたのなら、早く向こうのラボの方に教えなければ後々大変なことになるとも思いますし。

(無題) 削除/引用 No.3193-19 - 2010/09/14 (火) 22:13:40 - ATGC 強拡大でみたとき、ブラウン運動だと一カ所に留まってで振動してるように見える。細菌だと行動範囲がそれよりひろい、振動するというより、ある狭い範囲を、泳ぐというか動き回るように見える。マイコプラズマはあれは眼に見えないから違うと思う。しばらくしてへんな粒がきえるのは培地の抗生物質が効いて菌を抑え込んでいるのだと思う。凍結保存時も含めて培養前のストックが既に汚染してたようにおもう。取りあえず凍結保存液は新しく買い直した方がいい。マイコプラズマだとすると培地汚染ではマイコプラズマアルギニー二がよくあるけど、だとしたらデイミナーゼでアルギニン壊してそれでアンモニアできて培地はむしろ赤い方に傾くような気がするけど。

(無題) 削除/引用 No.3193-18 - 2010/09/14 (火) 21:22:35 - おお バクテリアの増殖が何らかの理由で抑制されているなら、それでも量によっては細胞の調子はLPSなどで悪くなり死ぬ細胞もでてきます。細胞の中身、特にリソソームの酸性成分の放出で酸性の方へシフトするのは早くなるかもしれません。

(無題) 削除/引用 No.3193-17 - 2010/09/14 (火) 21:12:11 - おお 培地の色が変わる前におそらく培地が濁ってくるのでそんな違いを見ているほど余裕はないと思いますけど。

(無題) 削除/引用 No.3193-16 - 2010/09/14 (火) 16:46:48 - コンタミ おおさん もしまだいらっしゃいましたらお尋ねしたいことがあるのですがよろしいでしょうか？ 私は今回、細胞が何かに感染しているとき大腸菌ではない。と勝手に決め付けてしまったのですが、大腸菌に感染していた場合は細胞や培地の色はどのようになりますか？ もし、おわかりでしたら教えていただければありがたいです。

(無題) 削除/引用 No.3193-15 - 2010/09/14 (火) 14:36:31 - コンタミ おおさん お返事ありがとうございます。 染色する方法は判断が難しそうですね。 ただ、PCRだとコストの面もありますし、難しいです。 もらう以前に感染していたのか、もらってきた後に感染してのかも問題になってきます。 いろいろ問題が山積みですが、一つ一つ解決していきたいです。

(無題) 削除/引用 No.3193-14 - 2010/09/14 (火) 12:57:05 - おお DNAをそめるほうほうは、経験がない方だと結論を出しにくいかもしれません。まわりとか近所に経験があるひとがいるなら、一度指導してもらうのがいいかもしれません。あるいはイメージをみせるか、、、

(無題) 削除/引用 No.3193-13 - 2010/09/14 (火) 12:52:04 - コンタミ おおさん お返事ありがとうございます。 たしかに、継代後はマイコが減っているのか普段通りの細胞である感じがして調子がいいです。 培地の色も普段通りで変化は見られません。 マイコ感染かは分からなかったのですが、除去薬を入れて何か差が見られないかと思い、今回検討してみました。 小さい粒は細胞を起こした翌日は、細胞の外にいます。 細胞を起こした次の日は普段、medium changeを行うのですが、そのまま観察してみようと思い、medium changeを行わなかったところ、小さい粒は減少していました。もしかしたら、細胞の中に取り込まれているのではないかと私は思ってしまいました。 経験論になってしまいますが、観察していて何かが違います。 一度しっかり染色してみなければならないと痛感してます。

(無題) 削除/引用 No.3193-12 - 2010/09/14 (火) 12:04:47 - おお 一度紹介されている方法でDNAをそめるか、マイコプラズマ検出用きっとをお使いになることをお勧めします。 マイコプラズマが感染すると、いろいろなことがおこり細胞の状態が変わります。死んでデブリスが普段より多く見られるとかいう可能性もあるかもしれません。 けいだい毎におこるのなら、マイコで弱った細胞がトリプシン処理でさらに調子が悪くなったりというのもあるかもしれません。たいていの場合はけいだい後はマイコがへって調子がいいことが多いのですが、、、 マイコは増殖にも影響しますが早くなる場合と遅くなる場合があります。また染色体の安定性もかわります。 培地は酸性に偏るのがはやくなり、非常に多くのマイコがそんざいすると、突然培地が酸性にかたより黄色、場合にはそれを通り越して緑色になったりもします。そうなってしまうと感染はほぼ明らかなのですがたいていの場合そこまでひどいことは起こりませんので発見が遅れることがけっこうあります。 マイコ除去用の試薬はその細胞が絶対に必要なときは使うのは致し方ありませんが、これも細胞に与える影響がかなりあり除去したあと細胞の性質が一緒かは保証できません。またうまく除けるかはやってみないとわからないかもしれません。かなりしつこいので。 なので、どうも怪しいとおもうなら一度コンタミを確定してからにした方がいいと思います。いずれにしても除去処理のあとには確認がいると思います。 ちょっと確認ですがその小さい粒、細胞の外にいますか?中ですか? なかだと液胞がでてるかもしれません。これは細胞が調子の悪いときに出やすいです。それが除去剤で消えるとなると確かに怪しいです。それでも一度確定してから手をとることをおすすめします。

(無題) 削除/引用 No.3193-11 - 2010/09/14 (火) 11:40:14 - コンタミ もう一度ストックした細胞を起こしなおしてみました。 そこで、一方のdishの培地にはMC-210(マイコプラズマ除去剤を)を添加してみました。 MC-210を添加していない方はやはり、なにか小さいつぶのようなものが存在していました。 MC-210を添加した方は、小さいつぶは存在しなくなりました。 やはりこれはマイコプラズマに感染しているのでしょうか？ マイコプラズマは目にみえないはずなのに、何かがいる気がします。

(無題) 削除/引用 No.3193-10 - 2010/09/13 (月) 19:34:58 - コンタミ おおさん お返事ありがとうございます。 しばらく継代して様子を見てみたいと思っています。 ~さん お返事ありがとうございます。 教えて頂いた情報をもとに検討してみたいと思っています。 MPさん お返事ありがとうございます。 私が培養している細胞は付着細胞なので直接染色できると思います。

(無題) 削除/引用 No.3193-9 - 2010/09/13 (月) 17:31:22 - ~ しまった。 感染時の写真像の例のつもりでリンクしましたが、 何も書いていなかったのでVero細胞に感染させるプロトコルを薦めている書き方になっていました。 固定以降のプロトコルを参考にしてください。

(無題) 削除/引用 No.3193-8 - 2010/09/13 (月) 17:04:19 - MP > 少し調べてみましたが、ヘキスト染色でしょうか？ > 核を染色することで感染の有無が分かるのでしょうか？ ~さんも書いていらっしゃる通りヘキスト染色です。~さんの紹介されているやり方は別の感受性細胞の感染させるやり方ですが、付着系細胞だったら直接染めても見えると思います。感染していると糸くずのようなものが多数付着しているのが細胞全体に認められます。

(無題) 削除/引用 No.3193-7 - 2010/09/13 (月) 16:12:32 - おお もしコンタミであるなら、各粒子のかたちは特徴があってそろっていると思います。酵母だときれいな丸い形を保っていますし。。。 デブリスのようなものだと、形に秩序性がありません。バクテリアだと強拡大に持っていかないと(40xぐらいかなぁ)形が認識できない場合もあると思います。

(無題) 削除/引用 No.3193-6 - 2010/09/13 (月) 15:33:03 - ~ ヘキスト染色は、マイコプラズマ検出法の1つです。 http://unit.aist.go.jp/pod/ci/tech_report/TR2006.1.pdf >確実に動いている気がします ブラウン運動と区別するのは難しいと思います。 以前、血清がコンタミしていたことがありました。 カナマイシンの失活のためか4日おきくらいに継代していると増えてこなく、 1週間置くと一気に増えだしました。 抗生物質無しの培地などに入れて、10日くらいインキュベートしてみてはいかがでしょうか。

(無題) 削除/引用 No.3193-5 - 2010/09/13 (月) 14:49:37 - コンタミ おおさん お返事ありがとうございます。 私も死んだ細胞のフラグメントか何かだと思っていたのですが、確実に動いている気がします。 大腸菌ではないようですは撤回します。 ただ、ときどき試薬を添加する際にコンタミを起こしてしまった時とは何か違うものが増えてきたので、大腸菌ではないようですと言ってしまいました。 MPさん お返事ありがとうございます。 少し調べてみましたが、ヘキスト染色でしょうか？ 核を染色することで感染の有無が分かるのでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.3193-4 - 2010/09/13 (月) 14:13:36 - MP 見えているものはマイコではないと思われますが、他のラボからもらった細胞でしたら、とりあえずヘキストで染めてみるのをお勧めします。

(無題) 削除/引用 No.3193-3 - 2010/09/13 (月) 14:07:34 - おお 強拡大でみると、特に小さな粒子は周りの水のブラウン運動の影響をうけて、動いているように見えることもあります。 >大腸菌ではないようです。 なぜそう言えるのかちょっと不思議に思いました。

(無題) 削除/引用 No.3193-2 - 2010/09/13 (月) 14:01:54 - おお 感染していれば、まず増えてきます。 マイコプラズマはおっしゃるとおり見えないと思います。 死んだ細胞のフラグメントや、血清成分のﾃﾞﾌﾞリスなどがよくコンタミと間違えられる要因になります。

マイコプラズマ感染でしょうか？ 削除/引用 No.3193-1 - 2010/09/13 (月) 13:47:59 - コンタミ いつも勉強させて頂いてます。 私は現在、ヒト癌細胞株を扱っています。 この細胞は他のラボから分けてもらったもので、分けてもらったその日に何本かストックを作成しました。 残りの細胞をしばらく培養し、よく観察してみたら、フラスコの中で何か小さいつぶのようなものが動いているのが観察されました。 大腸菌ではないようです。 そこで慌てて、最初にストックした細胞を起こしてみると、翌日、やはりフラスコの中で何か小さいつぶのようなものが大量に動いているように見えました。その日はそのままにして、次の日観察すると、何か小さいつぶのようなものはわずかに見えるのですが、ほぼ消えていました。 細胞はマイコプラズマに感染しているのでしょうか？ マイコプラズマは肉眼では見えないとよく耳にします。とすれば、細胞はいったい何に感染しているのでしょうか？ 以前に同じ細胞を見てきたので、今の細胞は正常でない感じがします。 同じような経験をされた方がいらっしゃれば、ご教授ください。 培地の色には変化はありません。

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