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(無題) 削除/引用 No.3190-8 - 2010/09/11 (土) 19:19:48 - イミダゾール みさん 丁寧にご回答いただきありがとうございました。 みなさまとても参考になりました。

(無題) 削除/引用 No.3190-7 - 2010/09/11 (土) 19:08:01 - み >[Re:6] イミダゾールさんは書きました : > みさん > > ありがとうございます。 > EDTAは入れなくても溶出はされそうですね。 > > みさんはわざわざEDTAなど入れず、SDS sample bufferを加えてboilでelutionしていますか？問題はありませんか？ EDTAは入れていません。普通のSDSサンプルバッファーです。

(無題) 削除/引用 No.3190-6 - 2010/09/11 (土) 18:34:26 - イミダゾール みさん ありがとうございます。 EDTAは入れなくても溶出はされそうですね。 みさんはわざわざEDTAなど入れず、SDS sample bufferを加えてboilでelutionしていますか？問題はありませんか？

(無題) 削除/引用 No.3190-5 - 2010/09/11 (土) 18:32:56 - イミダゾール qqさん、atsさん 早速のご返事ありがとうございます。 EDTAも考えていたのですが、EDTAを入れるとNiごと回収されてしまい危険かなと考えトピックを立てさせていただきました。 が、みなさんEDTAでやられていらっしゃるんですね。了解しました。ありがとうございます。 qqさんのように、EDTAにSDSが入っていればもうすぐにでもgelにapplyできますね。 またそれ以外にも用いれるようにatsさんのようにSDSを入れずEDTAだけの溶出のやり方もいいですね。 ちなみに、EDTA(1-10mM)だけで溶出したい場合、みなさんは洗いを終えたbeadsにEDTAを加えて、何分間がincubationしていますか？その際の温度は4度ですか？静置していますか？ 追加質問して申し訳有りませんが、どうかお時間があります際に、ご返答いただけますと幸甚です。

(無題) 削除/引用 No.3190-4 - 2010/09/11 (土) 18:29:03 - み >[Re:1] イミダゾールさんは書きました : > > 通常のProtein A-sepharoseで抗体でIPした際の溶出のように、SDS入りのsample buffer入れて煮れば溶出されるのでしょうか？みなさんの経験を教えてください。 適切な返答は「仰る通りSDS sample bufferでboilで良い」でしょう。

(無題) 削除/引用 No.3190-3 - 2010/09/11 (土) 18:18:03 - ats EDTAが入っていればOK

(無題) 削除/引用 No.3190-2 - 2010/09/11 (土) 18:16:41 - qq SDS+EDTA(1-10mM)でどうでしょうか？

cell lysateをNi-ビーズでIPした時の溶出方法について 削除/引用 No.3190-1 - 2010/09/11 (土) 17:54:24 - イミダゾール みなさんは、cell lysate (1% TritonX100入り) から、強制発現させたHixx6タグタンパク質をNi-beadsでIPした時の溶出は何で行っていますか？ 過剰量のイミダゾールでしか溶出できないわけではないですよね？ おそらく、pHを下げるなりしてもできるかと思います。 が、SDS-PAGEに持ち込みたいので、IPのほとんどをゲルにapplyできるよう少量の溶出が出来ればと考えています。 通常のProtein A-sepharoseで抗体でIPした際の溶出のように、SDS入りのsample buffer入れて煮れば溶出されるのでしょうか？みなさんの経験を教えてください。

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