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(無題) 削除/引用 No.3190-28 - 2010/09/15 (水) 10:08:33 - イミダゾール おおさん おはようございます。 ありがとうございました！

(無題) 削除/引用 No.3190-27 - 2010/09/15 (水) 00:50:15 - おお いい条件がみつかりほっとしました。

(無題) 削除/引用 No.3190-26 - 2010/09/15 (水) 00:37:19 - イミダゾール 一応、お知らせします。 私の目的：Hisx6-taggedタンパクを細胞に強制発現後、Ni-beadsでIP濃縮することです。 私の問題点；Ni-beadsに目的のタンパク質以外に、内在性のタンパク質が結構付いてくる。 私の今回の実験内容；これら望まないタンパクのbeadsへの吸着を阻害できれば、欲しいタンパク質の回収率、及び純度が増加するのではないか。 まず、Hisx6-tagged lysateとNi-beadsとの反応液に、Imidazoleを段階的に濃度を変えたものを加え、一時間、4度でrotationしたものを遠心後、sample bufferでelutionして、SDS-PAGEを行った。 Imidazoleの濃度は0, 5, 10, 20, 40, 80 mM（final conc.）の６段階。 結果、0->20と増加するに従って、欲しいタンパク質の回収量が増加した。（20 mMが回収量のpeak） しかし、40->80 mMでは逆に回収量は低下した。（80 mMではほとんど回収されなかった） 一方、純度に関して、 5 mMから徐々にnon-speは無くなり、40 mMでほとんどCBBでは見れなくなった。 まとめ：以上の実験から、Imidazole 20 mM存在下でcell lysateとNi-beadsをIPしたいと思います。 みなさまありがとうございました。

(無題) 削除/引用 No.3190-25 - 2010/09/14 (火) 14:21:39 - イミダゾール おおさん 更なるアドバイスありがとうございます！ いえ、作戦ミスが判明したため、後付けでこの対処法を考えただけです...（笑） こんな私でもポスドクなんですけどね、情けない限りです。 >それならまずはノンスペを気にせずできるだけ回収した方がいいので、レジンを増やして回収して、いろんな蛋白しつがノンスペでついてこようが、ネガティブコントロールで抗体で染まらなければよしで、いったんその実験に区切りをつけるくらいでいいのではないでしょうか。 ありがとうございます。 少しだけimidazoleを加えてノンスペが減るかの検討を行った後、おおさんの仰られる方法で進めたいと思います。ありがとうございました。

(無題) 削除/引用 No.3190-24 - 2010/09/14 (火) 13:59:10 - おお 状況がわかりました、lysosome画分にあることをいいたいので、そのフラクションからできるだけ6xhis tagのついたタンパク質を濃縮して載せたいわけですね。 それならまずはノンスペを気にせずできるだけ回収した方がいいので、レジンを増やして回収して、いろんな蛋白しつがノンスペでついてこようが、ネガティブコントロールで抗体で染まらなければよしで、いったんその実験に区切りをつけるくらいでいいのではないでしょうか。 co-IPのような事を考えてなければ、6xHISで落としたあと6M ureaやguanidineで洗浄も可能ですので、いくらかましになるかもしれません。もちろんいきなりureaなどでlysosome画分を溶解してもいいかもしれません。 しめされた実験では作戦ミスとまではいえないと思います。

(無題) 削除/引用 No.3190-23 - 2010/09/14 (火) 13:29:52 - イミダゾール ねこさん BMLからモノクロが出たんですね。 一度業者さんにお試し品を貰えないか聞いてみます。 ありがとうございます。 おおさん >でもNi-columnで致命的なのは、4つ以上Hisが並ぶ蛋白が哺乳動物などではかなりあることがあげられます。そう言う意味ではバックグランドが実験に邪魔をする可能性を考えてないと、知らなかったとはいえ作戦ミスです。 知らなかったわけではなかったのですが、cell lysateからNi-beadsでhis-tagged強制発現のタンパクをIPするので、abundantならばdominantに取れてくるだろうと素人考えで行ってしまいました。 仰る通り作戦ミスです。 今回の私の実験目的というのは、強制発現したタンパク質がどのオルガネラに局在するかを検討するためです。具体的には強制発現した細胞から密度勾配を利用してlysosomeに発現していればそれで良しという実験が行えればと考えています。 もちろん、免疫染色も行いましたし、そのアミノ酸配列から局在のpredictも行いました。 reviewerに強制発現でもいいので（endoでは見えません...）分画化したlysosome画分にも含まれるかwesternで検討しろと指示をいただきました。 しかしtagなしタンパクを発現させて抗体でIBしても分画したsampleのタンパク濃度がかなり低下してしまったため、his-taggedに切り替えて細胞を作ったところです。 結局はノンスペがいくら有ろうが、Ni-beadsでIPして（濃縮目的）、そのIP productsを抗タンパク抗体で見れれば問題はないかなと考えています。 ただおおさんが仰られるように本当にほしいタンパクがkick outされてしまっていたら元も子もありませんので、しばらく条件検討することにします。 みなさまありがとうございました。 また、作戦ミスを素直に受け止め、別のtagも考えながら実験を行って行きたいと思います。 この度はありがとうございました。

(無題) 削除/引用 No.3190-22 - 2010/09/14 (火) 10:34:48 - おお >こういう場合は、lysateとNi-beadsとのconjugation(4度, 1h with rotation)の際に、最小限のイミダゾールを加えて、非特異的結合が最小で、なおかつ目的のタンパク結合が最大となるイミダゾール濃度を求めることで改善できるのでしょうか？ ある程度はできるだろうとおもいます。 でもNi-columnで致命的なのは、4つ以上Hisが並ぶ蛋白が哺乳動物などではかなりあることがあげられます。そう言う意味ではバックグランドが実験に邪魔をする可能性を考えてないと、知らなかったとはいえ作戦ミスです。 単純にバックということであればたしかクロンテックがコバルトをキレートしたカラムの方がきれいというウワサをきいたことがあります。でもHisの並んだ配列でアフィニティーをかけるので根本的な解決にはなっていません。 ant-6xHisの抗体でNiレジンから溶出したサンプルでどれくらいバックがでるかで、どれくらいエンドのHisが並んだ蛋白がついてきたか様子が見れるかもしれませんので、それで評価するのも手かもしれません。

(無題) 削除/引用 No.3190-21 - 2010/09/14 (火) 10:15:28 - neko MBLの抗体で新しく抗His抗体（モノクロ）が出たみたいですよ。 お試しサンプルももらいましたがなかなか良いです。製品の容量は50ulと200ulのようです。 > > 6xHisは露出していることは確認できました。 > ちなみに抗Hisx6抗体で手頃の価格で容量が多くあるものは何かご存知ですか？ > 私はMBLの抗His抗体を使用していますが、100 ulで○万円でとてもIPに使う勇気がでません。。 >

(無題) 削除/引用 No.3190-20 - 2010/09/13 (月) 21:25:52 - イミダゾール みさん 改めてありがとうございます。 >大腸菌なので目的蛋白量は多量に存在する条件であり、100%の溶出が見込めなくてもCBBレベルで検出できていたのかもしれません。 >手間ではないでしょうからSDS bufferにEDTAを添加したものでBoilということで良いと思います。 この方法が自分の条件ではbestでした。ありがとうございました。 ただ、non-specific bindingが気になります。 lysateとNi-beadsとのincubationの際に少量のイミダゾールを加える事をこれから検討してみます。 おおさんが仰られるように、目的のタンパクのキックオフが抑えられ、回収量の改善が認められることを期待して頑張ります。 みなさま大変貴重なアドバイスありがとうございました。

(無題) 削除/引用 No.3190-19 - 2010/09/13 (月) 21:22:43 - イミダゾール モモさん、みさん ありがとうございます。 >イミダゾールさん駄目でしたか？嘘教えてしまったかなあ？ 提案された比較検討の結果をfeedbackしていただけると助かります。 いえいえ、嘘だなんて思ってはいません（笑） 経験に基づいたアドバイスで大変助かりました。 結果がでましたので、お知らせいたします。 私が使用しているNi-beads (Novagen)を使用して、Hisx6付きタンパクを細胞からbatch法でIPしました。その際のelutionとして5つの方法をみなさんからのアドバイスを元に行いました。 1→2xSDS sample bufferのみ（glycerol, Tris, SDS, 2-ME, BPB）+boil 2→1 mM EDTA in PBSのみ （boilなし） 3→10 mM EDTA in PBSのみ （boilなし） 4→2xSDS sample buffer+1mM EDTA　+boil 5→2xSDS sample buffer+10mM EDTA　+boil boilは、95度、3 min行い、その後、遠心して上清をSDS-PAGEしました。 結果、no.5が一番elution効率が良く、これを相対評価のため「10」としますと、 1→「8」 2→「0」 3→「2」 4→「8」 5→「10」 のような結果となりました。 これらより、今後、2xSDS sample buffer+10 mM EDTA+boilでelutionを行うことにします。 みなさまのおかげですありがとうございました。

(無題) 削除/引用 No.3190-18 - 2010/09/13 (月) 21:14:33 - イミダゾール おおさん >>あー、でもTrisは良くない場合があるって言いますよね。。 >私はリン酸をつかいます。 ですよね。今後、それを意識してリン酸ナトリウム緩衝液で精製を行うことも考えてみます。ありがとうございます。 >あとはNiからむは哺乳動物の細胞をつかうと本当にノンスペが多いです。のでキャパシティーオーバーで本当に必要な蛋白がキックアウトされている可能性もあるかもしれません。 これ、ずごいですね。 CBB染色で見たのですが、total cell lysateの多くのbandsが、Ni-beadsでIPしたsampleにも見られました。 こういう場合は、lysateとNi-beadsとのconjugation(4度, 1h with rotation)の際に、最小限のイミダゾールを加えて、非特異的結合が最小で、なおかつ目的のタンパク結合が最大となるイミダゾール濃度を求めることで改善できるのでしょうか？透析はちょっと手間がかかりそうなので、まずはこれで非特異的bandを消して、目的のタンパクの回収率を上げれないかと考えています。 6xHisは露出していることは確認できました。 ちなみに抗Hisx6抗体で手頃の価格で容量が多くあるものは何かご存知ですか？ 私はMBLの抗His抗体を使用していますが、100 ulで○万円でとてもIPに使う勇気がでません。。

(無題) 削除/引用 No.3190-17 - 2010/09/13 (月) 10:34:00 - み 自分の意見が二転三転するわけではないですが、 過去の実験を振り返ってみたところ、 SDS sample buffer(EDTA不含）でのboilで溶出可能だったのは大腸菌溶解液からの回収（ものすごくミニスケールです：菌液1-2mlの蛋白抽出物を樹脂10-20マイクロリットルで回収)で、単なる純度・回収率チェック用にバッチ法で行ったものです。 大腸菌なので目的蛋白量は多量に存在する条件であり、100%の溶出が見込めなくてもCBBレベルで検出できていたのかもしれません。 手間ではないでしょうからSDS bufferにEDTAを添加したものでBoilということで良いと思います。

(無題) 削除/引用 No.3190-16 - 2010/09/13 (月) 04:17:54 - モモ 私自身は学生時代にNiビーズでのプルダウンで、SDSサンプルバッファーの溶出をしたことがありますが、特に問題はなかったです。 ただ、少し気になるのは、Niビーズ自体はウレアの存在下でも蛋白の精製が可能なので、もしかしたら、SDS存在下でも結合が維持されているかもしれませんね。

(無題) 削除/引用 No.3190-15 - 2010/09/12 (日) 17:20:12 - み >[Re:10] イミダゾールさんは書きました : > みなさま > > cell lysateからNi-beadsを使ってHisx6タグタンパクをIPして、その後、PBSでwash後、まずは2xSDS-sample buffer（SDS, glycerol, Tris, 2-ME, BPB）を加えて95度, 3 minのboilをしてみました。 > > 結論はelutionされなかったみたい？でした。 イミダゾールさん駄目でしたか？嘘教えてしまったかなあ？ 提案された比較検討の結果をfeedbackしていただけると助かります。

(無題) 削除/引用 No.3190-14 - 2010/09/12 (日) 15:52:22 - おお >あー、でもTrisは良くない場合があるって言いますよね。。 はい。 この辺は場合によるのでうまくいく場合もあれば、、、 私はリン酸をつかいます。 NiからむでよくないHEPESでもうまくいったって言うのが知り合いでありましたから、本当にやってみないとわからないんですが、でもネガティブの可能性も考えると避けたいというのはあります。 あとはNiからむは哺乳動物の細胞をつかうと本当にノンスペが多いです。のでキャパシティーオーバーで本当に必要な蛋白がキックアウトされている可能性もあるかもしれません。 そう言うのも考慮して本当につかないのなら一度透析するとかも考えられるかとおもいます。単純にライセートのボリュームを3-10倍増やしてもうまくいくケースはあるかもしれません。 6xHis部分が露出してない状態になっているのであれば、さらに難しくなってくるかもしれません。その可能性をかんがえるなら、6xHis抗体をお持ちのようなのでそれでIPして評価できる可能性はありますね。

(無題) 削除/引用 No.3190-13 - 2010/09/12 (日) 15:21:09 - イミダゾール あー、でもTrisは良くない場合があるって言いますよね。。

(無題) 削除/引用 No.3190-12 - 2010/09/12 (日) 15:11:21 - イミダゾール おおさん いつもありがとうございます。 >cell lysateのバッファーはなんでしょうか? 私は、cell signalingの「10xcell lysis buffer」を使用しています。 1xに戻していますが、最終的には1 % TritonX100, 150 mM NaCl, Tris-HCl, あとはprotease inhibitorを加えています。pHは7.4で、Ni-Hisx6との相互作用に不利なpHではないと思っています。 おおさんは、待たずに行っていらっしゃるんですね。 それでやってみます。ありがとうございます。

(無題) 削除/引用 No.3190-11 - 2010/09/12 (日) 14:53:31 - おお >おおさんは、SDS sample bufferにEDTAを入れる際に、boilはされますか？ >またEDTAでelutionを意識して、少しだけ時間を待ってからboilしますか？ 待つ必要を感じません。 ボイルしている間でもEDTAは有効だと思えます。 cell lysateのバッファーはなんでしょうか?

SDS-sample bufferだけではだめみたい？ 削除/引用 No.3190-10 - 2010/09/12 (日) 14:28:33 - イミダゾール みなさま cell lysateからNi-beadsを使ってHisx6タグタンパクをIPして、その後、PBSでwash後、まずは2xSDS-sample buffer（SDS, glycerol, Tris, 2-ME, BPB）を加えて95度, 3 minのboilをしてみました。 結論はelutionされなかったみたい？でした。 ただ、ちゃんとNi-beadsに目的のタンパクが付いているかの確認はしなかったので、言い切れませんが。 今、もう一度実験を行っていますが、今回はちゃんとIPした上清をもSDS-PAGEしてみます。 更に、今回みなさまからご教示いただきました、他の方法をも検討しようとしています。 1. （昨日と同じで）2xSDS sample buffer+boil 2. 1 mM EDTA in PBS（boilなし？） 3. 10 mM EDTA in PBS（boilなし？） 4. 2xSDS sample buffer+1 mM EDTA in PBS （boilはする？） 5. 2xSDS sample buffer+10 mM EDTA in PBS （boilはする？） 6. total cell lysate これらをSDS-PAGEして、抗HisでIBしてみる予定です。 ちなみにtotal lysate（posicon）ではbandは出ます。 また1-5に関してはIPの上清もIBしてみます。 おおさんは、SDS sample bufferにEDTAを入れる際に、boilはされますか？ またEDTAでelutionを意識して、少しだけ時間を待ってからboilしますか？ どうかご教示いただけますと幸甚です。

(無題) 削除/引用 No.3190-9 - 2010/09/12 (日) 03:24:46 - おお sdsはNiカラムと相性がわるく、細胞溶解の時つかうと、目的の蛋白がほとんどつかないといわれてます。経験はありませんが、sdsだけで溶出できそうです。くわえてb-meが大量にはいってます。これも結合を阻害しますね。phは弱酸性でこれも結合にふりなじょうけんです。溶出に酸性のバッファー(pH6.5 PIPES)など使ったりすることもありますのでphでも溶出がかのうです。 総じて大量のbーmeの影響がメインでEDTAがなくても大丈夫ではないかというのが感想です。 でもわたしならねんのためEDTAを加えます。

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