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(無題) 削除/引用 No.3184-17 - 2010/09/14 (火) 12:28:37 - そら お礼が遅くなってしまい、すみません。 色々なアドバイスをいただき、どうもありがとうございました！ 共焦点顕微鏡や蛍光顕微鏡で、教えていただいた方法を試してもう少し頑張ってみて、それでも駄目なら 抗GFP抗体やGUS染色を検討してみようと思います。 どうもありがとうございました。

(無題) 削除/引用 No.3184-16 - 2010/09/12 (日) 06:56:11 - おお GUSは植物でよくつかいますね。 個人的にはこんふぉーかるの説明とか、自家蛍光の対処の仕方ばっかり書いていますけど、それをしろと強要しているわけでもありませんので、あなたの実験にいい方法が見つかるなら、ほかの方法でもいいとおもいますす。うまく実験がいくことを願います。

(無題) 削除/引用 No.3184-15 - 2010/09/12 (日) 06:47:23 - そら 早速、調べてみます！ どうもありがとうございます！

(無題) 削除/引用 No.3184-14 - 2010/09/12 (日) 04:03:44 - おお >共焦点顕微鏡や蛍光顕微鏡を使いこなせれば、なんとか自家蛍光との区別ができるようになるのではと思い、勉強中です。励起光を色々変えられるタイプの共焦点顕微鏡を使っていて、当てる波長を絞ってみたりしたのですが、うまくいっていないのが現状です…。 ライカのコンフォーカルでFITCとgfpのシグナルを波長特性から分けるというでもをやっていました。たぶん最初に波長特性をインプットしないといけないかと思います。 同時にそういうソフトがいりますね。お使いの顕微鏡のメーカーにも問い合わせるといいかと思います。 ライカは、プリズム分光で全波長スキャンできるのでそう言うことが可能なんだと思います。そのごzeissも波長がスキャンできるものを出してきたとおもいます。ちょっと方法論がちがったようにきおくしています。

(無題) 削除/引用 No.3184-13 - 2010/09/11 (土) 22:44:19 - そら なるほど、植物でタンパク質の組織局在（発現部位）を見る場合は、GFPよりもGUS染色の方が向いているのですね！ また、今GFPが見えている組織（条件）は、目的タンパク質が相当高発現していると考えてよさそうですね。 GUS染色、検討してみます。 どうもありがとうございます！！

(無題) 削除/引用 No.3184-12 - 2010/09/11 (土) 21:40:59 - natu 組織局在を観るのならGFPよりもGUSの方がいいのでは？ 植物では高発現プロモーターでないとGFPを観るのは結構厳しい。 組織局在ならプロモーター:GUS 細胞内局在なら35S：GFP一過的発現 細胞内で環境条件などによる局在の変化を見たい場合などには 35S：GFPのStableな形質転換体 ・・・というような使い分けをされる場合が多いと思います。

(無題) 削除/引用 No.3184-11 - 2010/09/11 (土) 19:04:22 - そら そうですね！何とか探してみます！ どうもありがとうございます。

(無題) 削除/引用 No.3184-10 - 2010/09/11 (土) 13:04:05 - おお メタノールやエタノール固定で見れるという話とだめという話両方ききますね。きっとシグナルはよわくなるのでしょう。 PFA固定後、デタージェントをつかって脂質を洗い流すこともできるかなぁと漠然と思っていますけど、まあ空想の話です。何とか経験のある人を見つけるのが手っ取り早いと思いますけど。

(無題) 削除/引用 No.3184-9 - 2010/09/11 (土) 12:22:27 - そら ＞おおさん どうもありがとうございます！ 自家蛍光の原因物質が分かれば、少しは対策を考えられるのではないかと思ってはいるのですが、確かに色素は原因としてありそうですね！ 有機溶媒はGFPの蛍光を消失させると聞いたことがあり、現在、固定はせずに、マイクロスライサーで切った切片を水に浮かべてそのまま観察しています。 共焦点顕微鏡や蛍光顕微鏡を使いこなせれば、なんとか自家蛍光との区別ができるようになるのではと思い、勉強中です。励起光を色々変えられるタイプの共焦点顕微鏡を使っていて、当てる波長を絞ってみたりしたのですが、うまくいっていないのが現状です…。 ＞natuさん アドバイスありがとうございます！ なるほど！現在観察しているのは、細胞内局在というよりは組織局在なのですが（細胞内局在までは見えないので…）、細胞内局在もぜひ見てみたいと思っています。一過性発現系の場合、発現量が強くてバックグラウンドが小さいというのは大変魅力的ですね！考えてみます。 ＞しそさん GFP蛍光と自家蛍光の波長プロファイルをとって、計算で自家蛍光を減らす…難しそうですが、やり方を調べて、試してみようと思います。 どうもありがとうございます！！

(無題) 削除/引用 No.3184-8 - 2010/09/11 (土) 05:46:16 - しそ 可変波長を見ることができる顕微鏡でGFP蛍光と自家蛍光の波長プロファイルを取って、弱いGFP蛍光を発する細胞から計算で自家蛍光を減らすことができるか、試したことがあります。 ある程度GFPの蛍光があればなんとかなる印象がありましたが、自家蛍光に対してGFP蛍光が弱いと、局在はわかるけれど、作ったような写真（というか点描というか）になりました。細胞でそうだったので、植物とかだと自家蛍光のプロファイルがぶれてもっと難しいような気がします。 ４〜５年前に試したので、今はもう少し状況が変わっているかなぁ？

(無題) 削除/引用 No.3184-7 - 2010/09/11 (土) 02:03:30 - natu 植物でGFPを使って細胞内局在を観るんだったら、 stableよりも一過的発現系の方がいいかも。 パーティクルガンとかプロトプラストとかで。 発現量も強いし、バックグラウンドとの差がはっきりしますよ。

(無題) 削除/引用 No.3184-6 - 2010/09/11 (土) 01:51:39 - おお いや、赤で自家蛍光がなくても、緑の領域に自家蛍光がないといってしまうのはきけんでしょう、、、 結構植物だといろんな色素もってそうですからね。それがかぶっているかもしれませんね。カロチノイドとか、、、 固定するのであれば固定方法で自家蛍光の出方は変わることは結構あります。色素をきにするなら、有機溶媒系で固定すると流れ出るかもしれません。 スペクトルがとれるコンフォーカルなら、自家蛍光の波長特性を差し引いた状態でという手もあるかもしれませんが、細かいことはよくわかりません。 吸収極大が大きく違うなら その波長でブリーチングも荒技ですができる可能性はあるかもしれません。ただ吸収極大をどうして知るかは手がないかもしれません。

(無題) 削除/引用 No.3184-5 - 2010/09/10 (金) 23:58:45 - そら どうもありがとうございます！ なるほど、赤色フィルターを用いて自家蛍光とGFPの区別を行うのですね。 やってみます！！

(無題) 削除/引用 No.3184-4 - 2010/09/10 (金) 22:59:20 - stu 植物は使ったことありませんが、マウス組織や、培養細胞でもGFP発現が弱いときは、GFP抗体でさらに緑色に染色したことあります。 自家蛍光の漏れは全く気にならなくなります。 自家蛍光を消すことはおそらく無理だと思います。 区別することは簡単で、GFPと何も染色していない状態で赤色フィルターも同時に覗くだけです。赤色フィルターは自家蛍光しか見えないはずです。緑色特異的なシグナルがGFP特異的シグナルだと考えてOKです。 同時にGFP発現していない同じ成長段階の植物も観察すれば、よりよいでしょう。

(無題) 削除/引用 No.3184-3 - 2010/09/10 (金) 22:38:44 - そら アドバイスどうもありがとうございます！ できる限りGFPをそのまま蛍光顕微鏡や共焦点顕微鏡で観察したいと思っているのですが、最終手段として抗GFP抗体を使うことも考えています。

(無題) 削除/引用 No.3184-2 - 2010/09/10 (金) 22:28:53 - ami 適当な(赤色とかの)タグがついた抗GFP抗体ではだめですか。

植物組織でのGFP観察 削除/引用 No.3184-1 - 2010/09/10 (金) 22:26:04 - そら 現在、大学院でイネの研究を行っているものです。 目的タンパク質の局在性（発現部位）を調べる目的で、目的タンパク質の上流領域にsGFPを連結させたものを導入した形質転換イネを作出しました。 蛍光顕微鏡や共焦点顕微鏡を用いて観察を行っているのですが、自家蛍光が強く、思うようにGFPが観察できません。 GFPは、まったく見えないわけではなく、子葉鞘などでは緑色蛍光が確認できました。しかし、葉や根、葉鞘においては、目的タンパク質の抗体を用いた免疫染色でシグナルが確認されているにもかかわらず、GFPの蛍光は観察できていません。 （自家蛍光にGFPが隠されてしまっているのかと思います。また、共焦点顕微鏡で観察したところ、野生型イネの葉も緑色に光っていました。） 自家蛍光をできるだけ減衰させる方法や、自家蛍光とGFP蛍光を区別して観察できる方法がありましたら、教えていただけたらと思います。 どうぞよろしくお願いします。

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