培養細胞からのトータルｃDNAを用いて、目的の遺伝子をPCRクローニングしています。
（方法はIsogenでRNA抽出、DNAse処理、逆転写PCR後(superscriptIII, ReverTraAなど）、目的遺伝子のプライマーでPCRする)
PCRで増幅が得られない場合は、しょうがなくESTクローンなどを購入しております。ですがラボの財政的に（またクローンを待つ時間短縮のため）できるかぎりトータルｃDNAからクローニングできればと考えております。
これまでの成果は1kbp以下の遺伝子はよく得られるのですが、1kbp以上の遺伝子をなかなかトータルｃDNAから得ることが出来ません。
できるかぎり長いｃDNAを得られるためには、どのような工夫が必要でしょうか？
よろしくお願いします。
今まで逆転写に用いるRNA量や、逆転写時のプライマー（ランダム、ポリA）、逆転写の伸長時間などを変えてみましたが、おおきな変化がありませんでした。 |
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