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追加情報 削除/引用 No.318-7 - 2009/04/21 (火) 17:56:27 - 匿名 heimlich様 以前書き込みしましたように私もしばしば低titerに悩まされているのですが、Clontech社のパッケージングキットを使用してtiterが上がったことがあります。 価格が高いのと、Invitrogen社とは細胞が異なり293Tに指定されていること（Invitrogenは293FTですよね）、テトラサイクリン不含の血清が必要なことから、手間はかからないのですが時間とお金が若干かかります。 私の場合は数倍程度のtiter上昇にとどまり、ものによってはtiterが改善されないものもありました。 お金と時間が許せば・・・といった感じでしょうか。 それではご幸運をお祈りしています。 またtiterについて良い発見などございましたら教えてください。

お返事が遅れてしまい申し訳ありません 削除/引用 No.318-6 - 2009/04/21 (火) 14:57:27 - heimlich お返事いただけましたTb様、~ 様、匿名様、ご連絡が遅くなり申し訳ありません。 ここしばらく、パソコンを使える状況になく、ようやくレスできる次第です。 まずは、ご丁寧なお返事ありがとうございました。 もともと、今回の実験において、先輩が理研より供与された第3世代のレンチウィルスにて、geneA-IRES-Venusをインサートとして使用していたものを、諸処の理由により、Invitrogen社のレンチウィルスに乗り換えて、VenusをgeneB（約1Kb）にするということで行っております。 このとき、先輩の方ではタイターが濃縮せずとも、実験に使用しうるレベルであったとのことで、同様の配列が含まれているのでタイターもここまで差が出るとは思ってもみず、何かプラスミドの量比がいけないのかと思い、ご相談させていただきました。 今後は、大量調整および濃縮にて実験を進めてまいりたいと思います。 ご指導ありがとうございました。今後ともよろしくお願い申し上げます。

RetroNectin 削除/引用 No.318-5 - 2009/04/16 (木) 03:12:23 - Tb 自分で使ったことないのでなんでずか、TakaraのRetroNectin、Cell BiolabsのViraDuctinという感染効率を改善させる試薬があります。あと、レンチウイルスをマグネット粒子に吸着させて、それを磁石で細胞に引きつけて感染効率を上げるというのもありますよね。感染のスケールが小さい場合はこういうのを使えるかもしれません。

ViraPower HiPerform 削除/引用 No.318-4 - 2009/04/15 (水) 14:40:35 - 匿名 私もインビトロジェン社のViraPower HiPerform を使用しています。 私の経験では、miRNAや2.5kb位の短いcDNAでは高い（といってもたかがしれている）titerのウイルスが取れますが、4kbを超えたinsertでtiterの高いウイルス液が取れたことがありません。 また、サイズが小さくてもなぜかtiterが高いウイルスが取れないinsertやプロモーター配列もあります。 ご質問のケースですが、かける時間は限られているというお話を第一に考えると、大量に調製して遠心で濃縮するのが手っ取り早いのではないかと思います。

(無題) 削除/引用 No.318-3 - 2009/04/15 (水) 08:53:49 - ~ Insertの長さが４kbだとさすがにtiterは極端に落ちてくると思います。 経験上、２〜３kbくらいが許せる限界という印象です。

ViraPower HiPerform 削除/引用 No.318-2 - 2009/04/13 (月) 23:38:50 - Tb Invitrogen pLenti7.3はViraPowerの新世代ベクターにあたり、いままでのInvitrogenのレンチベクターになかったcPPTとWPREエレメントが入っているので、タイターは従来品よりかなりよいはずです。ほかのコンポーネントプラスミドも293TもすべてInvitrogenのキットで用いているならば、最適化もほぼできているはず。 そうすると考えられるのは、１） ターゲット細胞が感染しにくい細胞である、２） 入れた遺伝子Ａ or Ｂがタイターを下げている、３） IRES配列がタイターを下げている、４）CMVプロモーターがあまり適していない細胞である、くらいです。 タイターは293Tとかの標準的細胞でもためしましたか？ときに目的遺伝子の挿入でmRNAが不安定化しタイターが激減することがあります。またIRES(-GFP)の挿入でウイルスタイターが数分の一になるという論文もあります。挿入遺伝子のない元のpLenti7.3でのウイスル産生を比較しましたか？ これらが原因の場合は濃縮でがんばるくらいしかないかもしれません。

レンチウィルスのタイターについて 削除/引用 No.318-1 - 2009/04/13 (月) 20:34:00 - heimlich 平素より勉強させていただきありがとうございます。 今回、実験において、皆様のご助言を賜りたく書き込みさせていただきました。どうかよろしくお願い申し上げます。 現在、Invitrogen社のレンチウィルスシステム(pLenti7.3)を使用しております。それに対して、約4kbのインサート（geneA-IRES-geneB）を組み込み、transient transfectionにて、発現を確認しました。 これを付属の293FTにてパッケージングしたものの、どうにもtiterが低く、濃縮を繰り返すしかないのか、もっと産生効率が高くなるのか試しているところです。 （レンチウィルスの本体に、EmGFPが入っており、293FTでのEmGFPの発現具合からは、293FTへのtransfection効率が悪いのが原因ではなさそうです。） あまり、時間的にも余裕がないので、もしこのようなことをご検討された経験のある方がおりましたら、アドバイスを頂けると幸いです。 よろしくお願い申し上げます。 （なお、transient transfectionにて、導入遺伝子の細胞毒性がないことは確認済みです。）

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