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(無題) 削除/引用 No.3179-4 - 2010/09/10 (金) 17:48:07 - ザンギ 数十ｎｇだと細胞数にして１０の４乗〜５乗くらいでしょうか。 逆転写キットやプロトコルによっては１μｇを基準にして組まれていて、鋳型 の量を揃えることである程度はバラツキを抑えられたりしませんでしょうか。 それより少なくて量が揃わなかったりすると、逆転写の反応効率にバラツキが 大きくなって再現性に影響しそうな気がします。 量を揃えられるなら揃えるほうがベターとは思いますが、１μｇである必要 はないでしょうね。

(無題) 削除/引用 No.3179-3 - 2010/09/10 (金) 12:57:09 - おお もし、あなたの実験でその辺りの厳密な考慮が必要と思われるなら、まずあなたのターゲットになる遺伝子が発現していると思われる細胞をつかって、1ugから下げていって遜色がないか確かめるというのも出来ませんか。 系が自分のラボ(手)で働くかどうかというのは誰も(どこのラボ)もやっている事ですし(今回のケースについて誰もが検討しているかはべつですが)。

(無題) 削除/引用 No.3179-2 - 2010/09/10 (金) 12:50:10 - おお まず、RTの酵素のとりせつを呼んでください。ナノオーダーでRT可能です。 また、マイクロアレーのキットはアジレントでは200ngでできるとかいています。それだけあればおおざっぱにほとんどの遺伝子のプロファイルはみれるといえます。もちろんパーフェクトとは言い難いでしょうけど。 さらにアレーでももっと微量のRNAでも検出できるように増幅して蛍光色素でラベルするものもあります。そう言うものでもだいたいのプロファイルはとれるからです。 あと、一つの細胞にどれくらいの量のRNAがあるかシミュレーションしてみてもいいかもしれませんよ。ご自分でやってみてはどうですか? そうすると数十ngはそんなに悪くない数字です。 だたRTの効率、プライマーの効率などここの場合によって変わりうるものもあり、微量の発現では多い方が有利です。また、1000個に一個の細胞が発現していてもいいとか(組織でポピュレーションが少ないターゲットをみているとか、サイトカインなどで分泌されて周りに影響がじゅうぶんみれるとか)の場合は考慮が必要かもしれません。 大抵は数十ngのレンジは検出可能だとおもいます。

PCRの信頼性 削除/引用 No.3179-1 - 2010/09/10 (金) 11:58:14 - gene いつも参考にさせてもらってます。今回は自身が遺伝子実験をスタートしだしたことから少し疑問に感じていることを質問させていただきます。 培養細胞などからRNA抽出を行い、その後cDNA合成をしてRT-PCRなどにもっていく場合のRNA濃度がよく理解できません。 論文などでは1μgのRNAを用いて以降の操作に移ったというのをよく目にしますが、実際PCRをかければわずかなRNAでも急増すると思います。 現在自分が行っている実験ではとても1μgのRNAを抽出できる状況ではありません。この場合、もっと少ない(例えば数十ng)量のRNAから以降の操作に移っても問題ないのでしょうか。自分の考えでは、最終的にRT-PCRなどでGAPDHを見て大差がなければいいのではと思うのですがどうなのでしょうか。ご教授のほう宜しくお願いします。

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