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RNAの検出について トピック削除
No.3177-TOPIC - 2010/09/09 (木) 14:34:50 - 学生
いつも勉強させていただいてます。

初歩的な質問ですいません。

HeLa細胞を固定したのち、
特定のmRNAについてin situ hybridizationを行い
確認したいと考えています。

可能でしょうか？

先生にはtotalのmRNA（いわゆるpolyARNA）でないと発現量が低いために
確認できないといわれたのですが・・・
　
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(無題) 削除/引用
No.3177-8 - 2010/09/09 (木) 23:40:07 - masa
皆様がおっしゃられるように実験自体は可能だと思いますので後はいかに先生を納得させるかだと思います。

一番良いと思われるのは実際にその系を用いている論文を複数集めて先生に見せることでしょう。細胞種や遺伝子が近いものだとより説得力が出るかもしれません。

それでも駄目なら代替案を提示しましょう。特定の細胞内構造や、タンパク質とのmRNAの相互作用が知りたいのであれば他のアプローチも見つかると思います。

実験の成功可能性、時間、コストからベストな手法を見つけ、周りと交渉して納得させながら研究を進めていくことが研究者の能力の一部になると思います。頑張ってください。

(無題) 削除/引用
No.3177-7 - 2010/09/09 (木) 22:37:05 - あかね
ES細胞でも他の培養細胞(Huh7)でもFISHやったことありますし、workします。

RNA-FISHには二種類あって細胞質のmRNAを検出するRNA-FISHとde novo transcriptionを検出するRNA-FISHがあります。

発現を確認するだけならRT-PCRやNorthern Blottingで充分しょう。FISHのメリットはRNAの細胞内での局在確認と発現している細胞としていない細胞の区別でしょう。定量性は無いです。

培養細胞のin situ hybridization 削除/引用
No.3177-6 - 2010/09/09 (木) 21:43:25 - Actias
ショウジョウバエの卵や成虫原基では、やったことがあったので、
できるかと思い、トライしたことがあります。
できませんでした。

目的
Embryoid body （浮遊）形成後、分化誘導し、培養シャーレ
に接着したES 細胞群のどの辺りの細胞が、自分の興味の遺
伝子を発現しているか見たかった。

方法
ガラス底プラスチック培養プレートに接着した細胞群をホル
マリン固定後、メタノール、アセトン、キシレン等で細胞を
処理。（予定では、このあとフォルムアミドベースのバッフ
ァでDIG-RNAプローブでハイブリ）

結果
培養プレートのプラスチック部分が変形し、ハイブリまで
至らなかった。

投げかけ
Embryoid body のように、立体的なものだったので、ハエ
の手法を使いましたが、HeLa などでは、成功するもので
しょうか？

すいません 解決済み 削除/引用
No.3177-5 - 2010/09/09 (木) 15:54:45 - 学生
ありがとうございました

(無題) 削除/引用
No.3177-4 - 2010/09/09 (木) 15:53:00 - 学生
＞＞みなさん
すいません。
in situの原理、それくらいは理解しています。
しかし、先生にはそういわれてさせてもらえないのです。
ですからお聞きしたのです。
質問をまちがえましたね・・・すいませんでした。

(無題) 削除/引用
No.3177-3 - 2010/09/09 (木) 15:02:03 - おお
FISHっていう方法があって、染色体のどこに遺伝子があるかmRNAのin situ hybridizationににたほうほうでハイブリで検出できる方法があるんです。

ここで読むのを止めて一度なんでそんなこといっているかちょっと考えてみてください。















遺伝子は染色体に１コピーの場合がたいていですよね。一個ハイブリするターゲットがあれば染まるんです。

たぶん先生は検出感度でなくて、手技が難しいといってると思いますけどどうでしょうか。
in situ hybridizationは定量的な解析も難しいので、実験で何を示すかよく考えて実験計画を立ててください。

mRNAのin situ hybridizationはFISHほど感度を出さなくていいことがほとんどかと思いますけどね。

(無題) 削除/引用
No.3177-2 - 2010/09/09 (木) 14:42:33 - は？
in situ hybridizationをもう少し勉強しましょう。

そもそも、特定のmRNAを検出するのがin situ hybridizationという実験方法です。

＞先生にはtotalのmRNA（いわゆるpolyARNA）でないと発現量が低いために
確認できないといわれたのですが・・・

もう一度ちゃんと先生がどういうことを言ったのか、確認しましょう。


in situ hybridizationが何たるかを理解していないあなたが、
先生の言ったことの意味をちゃんと把握しているとは思えません。

RNAの検出について 削除/引用
No.3177-1 - 2010/09/09 (木) 14:34:50 - 学生
いつも勉強させていただいてます。

初歩的な質問ですいません。

HeLa細胞を固定したのち、
特定のmRNAについてin situ hybridizationを行い
確認したいと考えています。

可能でしょうか？

先生にはtotalのmRNA（いわゆるpolyARNA）でないと発現量が低いために
確認できないといわれたのですが・・・
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