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(無題) 削除/引用 No.3166-14 - 2010/09/09 (木) 13:13:25 - 新入り 試しに　様 大変参考になりました。 先輩にもお願いし、両方で実験を行う予定です。 サンプルなのか手技なのか、原因が絞れたところで、 次なる実験の組立てを行ないたいと思います。 おお　様 コメントありがとうございます。 皆さんから頂いた内容を元に実験を組立てます。 実験の組立てに関しても自ら行えるよう練習致します。

(無題) 削除/引用 No.3166-13 - 2010/09/09 (木) 12:47:03 - おお >ご教授頂いた以下に注意し、再度試みる予定でおります。 うまくいけばいいですね。 うまく解決方法、原因究明に向かう方法で、実験を組み立てていってください。前回のコメントはそう言う意味で発言しました。

(無題) 削除/引用 No.3166-12 - 2010/09/09 (木) 11:56:27 - 試しに ・先輩にゲルを２枚作ってもらう ・質問者さんも２枚作る。 先輩ゲル１：良好なバンドが確認されている先輩のポジコンを流す 先輩ゲル２：バンドが歪む質問者さんのサンプルを流す 質問者ゲル１：良好なバンドが確認されている先輩のポジコンを流す 質問者ゲル２：バンドが歪む質問者さんのサンプルを流す （サンプル間のイオンバランスが異なると歪む原因になる場合があるので、上記では１枚のゲルで質問者、先輩のサンプルを一度に流すような手抜きは避ける。レーンが余る場合は１×サンプルバッファーを流す） ＷＢ後、ＣＢＢ染色し全体像を確認する。 ----------------------------------------- と、いうのはいかがですか？

(無題) 削除/引用 No.3166-11 - 2010/09/09 (木) 10:41:24 - 新入り 皆様 ご返答誠にありがとうございます。 ご教授頂いた以下に注意し、再度試みる予定でおります。 1）自作ゲル下部の泡抜き 2）コントロールを用いる 3）不安のある試薬等は先輩からお借りする 濃縮ゲルに出来る白い物についてはSDSの可能性があるとのことですので、 私なりに再度調べ、方法を検討することを考えています。

(無題) 削除/引用 No.3166-10 - 2010/09/09 (木) 09:08:52 - qq PIERCE(wako)のパンフをみると、20mM EDTAまでOKだと、言っているので、まぁ、良いんでしょうね。（お騒がせだったような、失礼）

(無題) 削除/引用 No.3166-9 - 2010/09/08 (水) 23:31:40 - ATGC Triton X 100とSDSは合わない。SDS変性後に蛋白質を再生するときTriton Xとか使うし。SDS-sampleを作成した時に最終濃度としてTriton XがSDSよりも十分に低い濃度でないとSDSの変性効果が減弱してしまうとおもうのだけど、抽出液とSDSサンプルバッツファーはどんな感じの比率で混ぜてます？。 あと、よくやるみたいに、直接、細胞をSDS sample buffer(2ME and 青は抜き）でとかしたらだめかね？。

(無題) 削除/引用 No.3166-8 - 2010/09/08 (水) 20:39:11 - qq ＞1）泳動タンパクはBCA kitにて定量後、20ug/レーンにしております。 ＞3）1% Triton X-100 in PBSにEDTAを加えたもの培養細胞に加え、 BCA kitを使ったことがないのですが、Cu-BCA発色のkitでEDTA入りのサンプルをタンパク定量できるのですか？

(無題) 削除/引用 No.3166-7 - 2010/09/08 (水) 14:44:01 - ~ 波打つのであれば、ゲルの出来やサンプルの塩濃度が気になります。 先輩の作ったゲルを1枚貰って泳動しても、波打つのでしょうか？ 先輩の余ったサンプルを貰って全レーンにアプライして泳動しても、波打つのでしょうか？ 貴方のサンプル1種類を全レーンに泳動しても、波打つのでしょうか？ 先輩に小分けしてもらったx4 SDS bufferを使っても、波打つのでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.3166-6 - 2010/09/08 (水) 11:13:19 - おお マーカーがきれいに流れていたら、サンプルに問題がある可能性があるとまずは思えます。 サンプルに問題があるとすれば、どうしますか? コントロールって言葉がありますよね。ちゃんと今までにきれいに流れていたサンプルをどなたからちょっと使わせてもらう。で両方きれいに流れなかったら、サンプルに問題がある可能性という仮説は否定的です。 じゃあゲルかなぁとかバッファーかなぁ、、試薬を混ぜるときに問題あったかなぁって、、、 濃縮ゲルのウェル の部分に白い物がたまってるんですよね。 不要物が取り除けていないか、sdsが析出しているのかもしれません。 ボイルすると思いますが、そのあとオンアイスだと場合によってはSDSが沈殿する可能性があります。 いろいろ可能性があると思いますが切りがないので、ちょっといまの段階ではこれ以上書きません。

(無題) 削除/引用 No.3166-5 - 2010/09/08 (水) 10:54:03 - in situ 自作のゲルの場合、ゲルの下部に空気が大量に入っていると泳動がみだれることがあります。 泳動バッファーを注いだ後に空気が入っていないか確認してみてください。 あとはゲルを作るときの混和が不十分とか…

(無題) 削除/引用 No.3166-4 - 2010/09/08 (水) 10:20:41 - 新入り ご返答ありがとうございます。 1）泳動タンパクはBCA kitにて定量後、20ug/レーンにしております。 2）ゲルは10％です。 3）1% Triton X-100 in PBSにEDTAを加えたもの培養細胞に加え、 オンアイスにて15分、その後セルスクレーパーにて掻きだし、 12000rpm☓15min遠心し、上清を回収、-80℃保存しています。 4）ゲル1枚につき、150V、30mAに設定し、1時間ほどです。 以上、よろしくお願いいたします。

(無題) 削除/引用 No.3166-3 - 2010/09/08 (水) 09:58:58 - 試しに ・泳動タンパクは　〜ug/レーンですか？ （たとえば先輩のメンブレンと質問者さんのメンブレン、両方をＣＢＢ染色すると泳動したタンパク量に明らかな差がある　という可能性はありませんか？） ・ゲルの％は？ ・可溶化のプロトコールは？ ・泳動電圧、電流および泳動にかかる時間はどのくらいですか？

NIH3T3によるWestern Blottingについて 削除/引用 No.3166-1 - 2010/09/08 (水) 09:33:52 - 新入り いつも拝見させて頂いております。 この春より生化学実験を始めた初心者です。 現在、NIH3T3を培養し、蛋白を回収後、WesternBlotを行っており、 目的蛋白の発現を確認することを目的としています。 しかし、目的蛋白以前に、beta actinでバンドが波を打つように歪み、 綺麗なバンドが確認できず、悩んでおります。 実験プロトコルはサンプル回収から検出まで、ラボの方と 同様にしており、変更点は細胞の種類のみです。 試薬は共通で使用しているため、原因は低いと思われます。 気になる点としては、泳動後の濃縮ゲルのウェル部分が 白く変色していることです。 回収または泳動、あるいは細胞そのものに問題があるのか、 指導者にも相談しておりますが、はっきりとした原因がつかめず、 これまで5回条件変更しましたが、同様の結果となりました。 説明不足な点も多く、分かりづらい質問ですが、 次回の条件変更等に関してご教授頂ければ幸いです。 何卒よろしくお願いいたします。

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