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(無題) 削除/引用 No.3164-11 - 2010/09/09 (木) 15:16:50 - 組織 >顕微鏡様、う様 説明不足および調査不足で申し訳ありません。ご指摘の通り、フィルターセットを調べてみて、担当業者にどの波長が合うかを聞いてみるつもりでした。今フィルターを見てみたら、赤は650/LPが入っていました。教えて頂いたサイトで見てみると、現在のセッティングでは568が最適のようでした（555と594は同程度の効率。Cy3や555は緑への漏れ込みがやや大きく、568と594ではあまり漏れ込みなし）。 結局、555と568の観察下の違いというのも、レーザーおよびフィルターセットの組み合わせによるものなんでしょうか。よく調べもせずに質問して申し訳ありませんでしたが、555と568でこれほど差があるとは知りませんでした。大変参考になりました。

(無題) 削除/引用 No.3164-10 - 2010/09/09 (木) 12:38:46 - う 色素がどっちがいいかとか、 まずは機械とここでも調べるのが先決かと。 http://www.bdbiosciences.com/external_files/media/spectrumviewer/index.jsp 色素の使用感は、全く励起波長が同じ色素が複数ある場合なら どっちが良いかと聞く意味はあると思うが、 そもそも励起波長が違う色素で、かつレーザーはドンピシャではいのに どうなのかって聞くのは意味がないと思いますが。

(無題) 削除/引用 No.3164-9 - 2010/09/09 (木) 12:17:02 - 顕微鏡 長波長側にシフトしているようですが、フィルターセットは対応しているのでしょうか？ FITC, Rhodamine, +Cy5 + DAPIの組み合わせでフィルターを組むケースが多いと思いますが、この場合594はかなり暗くなるのではないかと。 フィルターセットの波長を調べるのが先ではないでしょうか。

(無題) 削除/引用 No.3164-8 - 2010/09/09 (木) 10:35:50 - 組織 皆様ご意見ありがとうございます。大変参考になります。 最終的には、Alexa488と二重染色しますので、568か594に決めようかと思います。 以前に同じ機械・セッティングで、580nmくらいの色素を使ったことがあるので、594でも検出できるんじゃないかと思ってますが、その辺りも含め一度業者に聞いてみます。 二重染色の漏れ込みについては、これまでもCy3を使っていますので、概ね問題はクリアできてると思っています。HRP-DAB系との相同性や、蛍光単染色での確認など、この辺は専門的にやっておりますので、見るべきものを検出できていると考えています。 >あかね様 私も、568と比べて555の方が弱い気がする（曖昧ですが）という話を聞いてましたので、ご意見参考になりました。 まだ情報をお待ちしておりますので、よろしければコメントお願いします。

(無題) 削除/引用 No.3164-7 - 2010/09/09 (木) 06:11:13 - あかね 個人的な感想ですが、Cy3, Ax568よりもAx555の方が褪色が早い気がします。

(無題) 削除/引用 No.3164-6 - 2010/09/08 (水) 17:41:30 - 顕微鏡 私は546と555をいつも使っています（レーザーは543ですが）。 555では、Alexa488やGFPの蛍光が強いとブリードオーバーし、シークエンシャルスキャンが必要になることが多いです。568もalexa647にブリードオーバーしますから、二重染色の相手の色素しだいです。 単に輝度で決めるなら吸光係数と量子収率を調べればいいはずですが、退色の早さ、蛍光フィルターのバンド位置も関係するので、使われている顕微鏡で555と568の両方で実際に写真をとって見た方が安全だとおもいます。 http://www.invitrogen.com/site/us/en/home/brands/Molecular-Probes/Key-Molecular-Probes-Products/alexa-fluor/Alexa-Fluor-Dyes-Across-the-Spectrum.html

(無題) 削除/引用 No.3164-5 - 2010/09/08 (水) 17:36:10 - ああああ もし、Alexa488と二重染色するのであれば、Alexa568よりAlexa594の方が漏れ込みを気にしなくていいので、お勧めですよ。 Alexa594を使えるかどうかはレーザーとフィルター次第ですが。

(無題) 削除/引用 No.3164-4 - 2010/09/08 (水) 16:36:52 - stu 確かに561nmだとどちらが良いのか微妙ですね。 個人的にCy3を使用したことがないので、Alexaと比べて、違うのかどうか分りませんが、私のラボではAlexa568を使用して問題は何もありません(568nmレーザー）。 あと、蛍光の選択はダイクロや吸収フィルターにもよるので、細かいことが分らない場合は正確にどちらがその顕微鏡に適しているかは、その顕微鏡をセッティングした業者に聞いたほうが一番確実だと思います。 個人的に心配なのはGFPやAlexa488と二重染色するときにCy3だと微妙にかぶってしまうような気もしなくもないですけど、どうなんでしょうか。 二重染色の必要がないのであれば問題になりませんけど。

(無題) 削除/引用 No.3164-3 - 2010/09/08 (水) 08:14:06 - 組織 ご教授ありがとうございます。 561nmレーザーなので、どちらでもあまり変わらないかなと思ってます。 安定性、輝度、鮮明度などはどうでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.3164-2 - 2010/09/07 (火) 21:02:41 - stu 適切な色素を選ぶということは 他のラボがどの色素を使っているかどうかでなく、 組織さんのラボの共焦点顕微鏡のレーザーが何を使っているかによります。 そのレーザーの最大励起波長とちょうど合う蛍光色素であるかどうか。 レーザーが568nmならAlexa568でよいと思います

Alexaシリーズの赤色色素 削除/引用 No.3164-1 - 2010/09/07 (火) 18:56:58 - 組織 蛍光免疫染色で、Alexa標識二次抗体の購入を考えています。 赤色色素だと555とか568とかあるのですが、どの波長の色素を使われてますか？ 観察にはコンフォーカル顕微鏡を使います。ちなみに今まではCy3を使ってました。 メーカーHPを見ると、568がコンフォーカル観察に適しているのかなという印象を受けましたが、正直よくわかりませんでした。 Alexa 555と568のどちらを使っているか、あるいはどちらの方が良いか、など皆様のご経験を教えて下さい。よろしくお願いします。

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