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(無題) 削除/引用 No.3163-10 - 2010/09/17 (金) 17:22:37 - ddd みなさま 本日、クローニングした断片のDNA配列を解析しましたところ、無事に5つすべてのイントロンが除かれたcDNAを得る事ができていました。一番サイズの小さいバンドを切りだし、クローンニングに使用したので、ピックアップしたコロニーはほぼすべて目的のサイズの断片を含んでおりました。少し驚いておりますが、ひとつずつイントロンを抜いていく面倒なコンストをデザインする手間を考えると、比較にならないぐらい楽に出来たのでとても助かりました。アドバイスを有難うございました。

(無題) 削除/引用 No.3163-8 - 2010/09/13 (月) 13:01:49 - ddd みなさま コメントを有難うございました。 運がよければ5つのイントロンが抜けたcDNAがとれるかも知れないわけですね。今後、大腸菌での組換え蛋白質発現なども予定しておりますので、やはりイントロンのあるものはたとえ培養細胞でスプライシングが上手くいったとしても、使い勝手が良くありません。そこで今現在、ああああさんの仰るように培養細胞からスプライシング済みのcDNAをとる事を試みております。 （定法に乗っ取ったcDNAクローニングも並行しておりますが、こちらは全く増えてくれる気配がありませんので、なんとか手元のゲノム断片で頑張ってみようと思っております。） 培養細胞にトランスフェクションしたものからtotalRNAを調製し、逆転写したものからPCRで目的の遺伝子のcDNA増幅を試みました。その結果、サイズ的には、ゲノム断片（未スプライシング）と思われるものから、スプライシングが上手くいったと思われるものそれから、中間的サイズのもの（中間体orバリアント？）まで、幾つかのバンドが増えました。一番サイズの小さいバンドが、ほぼ目的のスプライシング後のサイズと一致しておりますので、希望が持てるのではないかと思っています。 また結果をご報告させていただきます。

(無題) 削除/引用 No.3163-7 - 2010/09/11 (土) 04:41:42 - おお >正直なところ、イントロンが五個もあるのであれば、プラスミドのtransient transfectionで正常のスプライシングプロダクトのみうまく作られるという事は奇跡に近いと思います。 奇跡はちょっと大げさだと思います。 ミニジーンを使うときは選択的スプライシングを見ることがおおく、弱いスプライシングなども存在します。でクリプティックなスプライシングも起こることはまあまああります。 これが実際にゲノムでおきているかは、よくわかりません。おそらくまあまあの確率でおきていて、NMDで壊されるので見れていない可能性はあります。ただタンパク発現を考える上でクルプティックなものがNMDをかいくぐってたくさん出てきては厳しいものがありますけどね。 。 mutual exclusiveのスプライシングを見るためのミニジーンとかだと、片っ方だけが取り込まれるというきれいな再現性をどうゆうわけかとらないというのもまあまああります。 どちらにしろ懸念は拭えないわけで、奇跡的といわれた方があきらめはつくでしょうけどね。

(無題) 削除/引用 No.3163-6 - 2010/09/10 (金) 22:23:24 - splicingは一筋縄ではないです 正直なところ、イントロンが五個もあるのであれば、プラスミドのtransient transfectionで正常のスプライシングプロダクトのみうまく作られるという事は奇跡に近いと思います。 大半以上がどこかにミススプライシングを起こしたプロダクトになると予測されます。 ゲノムからのnativeな転写に伴うスプライシングと、強制発現用のプラスミド上のmini geneの挙動は大幅に異なります。この辺りの理由はまだ完全には解明されていませんが。

(無題) 削除/引用 No.3163-5 - 2010/09/10 (金) 18:29:07 - ああああ イントロンを含んでいることが気になるんですよね？ イントロンを含んだままのクローンが取れているのであれば、細胞にトランスフェクションして、再度クローニングしたらイントロンの抜けたものが取れるんじゃないでしょうか？ うまくスプライシングされなかったら無理ですけど。

(無題) 削除/引用 No.3163-4 - 2010/09/10 (金) 18:20:04 - A 以前バキュロウイルスの発現を使った際にこの系のメリットをマニュアル で確認した際、「ゲノムを入れたコンストラクションでも蛋白質発現できる」 と書いてありました。ですからヒト培養細胞でもうまく蛋白質発現する 可能性が高いと思います。ただし、おおさんの指摘されている部分は気に なりますね。

(無題) 削除/引用 No.3163-3 - 2010/09/07 (火) 23:59:06 - おお スプライシングバリアントがあれば、アイソファオームが細胞によって違う割合で発現するかもしれません。層なると厄介ですね。 constitutiveなスプライシングほぼ大丈夫でしょけど、その発現に使うDNAの最初のエクソンや最後のエクソンがパーシャルなばあい、スプライシングファクターをリクルートする十分なインフォメーションを持ってないかもしれません。その辺りがチョット危ないかも。 プロモーターによってスプライシングのされかたが運命づけられることもありますので、これも一寸微妙ですね。ただ、イントロンを含む発現ベクターはたまに見かけますので(人工的に構築したものと、ゲノムをほりこんだもの)慎重に様子をみなが、cDNAを改めてとる方向で進めていった方が無難です。

(無題) 削除/引用 No.3163-2 - 2010/09/07 (火) 18:51:36 - 中年 そんなこともあるんですね。 まず大丈夫だと思います。本来の発現量が極端に低い遺伝子で、それを無理矢理高発現してしまうような場合は問題あるかもしれませんが。

プラスミド由来転写産物のスプライシング 削除/引用 No.3163-1 - 2010/09/07 (火) 18:41:56 - ddd ある遺伝子のcDNAをクローニングしようとしたのですが、ゲノムのコンタミから予期せずその遺伝子のゲノム領域を増幅してしまいました。このゲノム断片を発現プラスミドにクローニングし、ヒト培養細胞にトランスフェクションした場合、このプラスミド由来の転写産物は問題なくスプライシング等の修飾を受けて蛋白質が合成されますでしょうか？ クローニングしたゲノム領域は開始コドン上流10塩基から、約300塩基の3'UTRを含む全長約3000塩基対のもので、100〜300塩基対程度の小さなイントロンが5個含まれるものです。 ご教示のほど宜しくお願い致します。

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