ウェスタンブロットが上手く行かなくて困っています。
なぜか一度目のECL検出後にリプローブしないとバンドらしくならないのです。
初代培養細胞（目的蛋白のポジコンとして用いられる細胞です）の蛋白をRIPA bufferで溶出後、4x sample buffer（10% SDS）を加えて95℃, 5min boilし、15% polyacrylamid gelで泳動します。1レーンあたりの蛋白量は15μgです。
転写はセミドライ方式で行い、メンブレンはPVDFを使用しています。
ブロッキングには5% BSA、washにはTween-TBSを使用しています。
このメンブレンでβ-actin（mouse IgG）を検出すると、特に問題はなさそうに見えます。バックも出ず、シャープなバンドが得られます。
検出にはECL Plusを用いています。
しかし、上記と同様の手順で得られた別のメンブレンで目的蛋白（goat IgG）を検出しようとすると、メンブレン全体がボーっと白くぼやけたような写真になってしまいます。ぼやけた中にラダー状の濃淡があり、無数のバンドのように見えます。
抗体の動物種が異なる場合はリプローブの際に最初の抗体をはがさなくても良いとのことなので、β-acrinのバンドが確認できた方のメンブレンをT-TBSで洗浄し、ECLの蛍光が無くなったことを確認した上で、今度は目的蛋白を検出しようとしました。再ブロッキングはせず、リプローブの手順は一次抗体反応からです。
すると、非特異バンドも多いものの以前のようにぼやけたりせず、シャープなバンドが得られました。その後、同じ方法で抗体の希釈倍率や露光時間を調整することでそこそこ綺麗な写真になりました。
でも、目的蛋白はこのようなリプローブの時にしか検出できないのです。これは最初の検出がβ-actinでなくても同様です（普通はやりませんが、一度目に目的蛋白を検出しようとしてやはり全体が光ってしまったメンブレンを、もう一度洗って再度目的の抗体で処理してみました。するとバンドが得られました）。とにかく何かを一度検出して、そのメンブレンをTween-TBSで洗って、ECLの蛍光が失われたのを確認してから目的の一次抗体・二次抗体を処理しないといけないのです。そうしないと、メンブレン全体がボーっと光ってしまいます。
これはどうしてなのでしょうか。
目的蛋白の抗体は複数持っています（goat）。目的蛋白のリン酸化を検出する抗体もあります（goat）。二次抗体もたまたま古いものと新しいものとがありそれぞれメーカーも異なりますが、どの組み合わせを使っても一度目はぼやけます。
どうかご指導よろしくお願い致します。
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